Kan metylenblått kringgå mitokondriellt komplex III? Varför studierna ger olika svar

Två laboratorier undersökte om metylenblått kan kringgå ett blockerat mitokondriellt komplex III. Det ena svarade nej. Det andra svarade ja. Båda hade data.

Den första studien, på mitokondrier från mushjärna, fann att färgämnet inte kan det. Den andra, på hjärnmitokondrier från tre gnagararter, fann att det delvis kan det. En tredje studie, på muslever, citeras ofta i samma sammanhang men undersökte något annat. Håll isär den från de andra, så försvinner hälften av förvirringen.

Det finns ingen universell mekanism att slå fast. Det finns tre experiment med olika blockerare, doser och mätvärden. Läs försöksbetingelserna först. Slutsatserna följer av dem.

Vad det innebär att kringgå ett komplex här

Elektroner kommer in i kedjan via komplex I (från NADH) eller komplex II (från succinat), passerar genom komplex III till cytokrom c och sedan genom komplex IV till syre. Gradienten som byggs upp längs vägen är det som cellen använder för att bilda ATP.

Påståendet om en förbikoppling innebär att metylenblått tar upp elektroner uppströms om en blockering och lämnar av dem nedströms. Det oxiderade färgämnet tar emot elektroner från NADH eller tidiga komponenter i kedjan och blir leukometylenblått. Den reducerade formen lämnar sedan över dem till cytokrom c eller tillbaka till kedjan. Om överföringen sker nedströms om blockeringen återhämtar sig respirationen och membranpotentialen delvis. Om den sker vid eller uppströms om blockeringen sker ingen återhämtning.

En detalj i komplex III avgör mycket av denna diskussion. Komplexet driver en Q-cykel med två bindningsställen för hämmare. Antimycin binder till Qi-stället. Myxotiazol binder till Qo-stället. En studie som bara använder den ena har bara undersökt halva komplexet.

Studie ett: ingen förbikoppling i mitokondrier från mushjärna

Gureev och kollegor använde mitokondrier från hjärnbarken hos C57BL/6-möss, isolerade med digitonin och analyserade vid 0.1 mg protein per ml. Substraten omfattade tre upplägg: pyruvat plus malat vid 5 mM vardera, succinat vid 10 mM med glutamat vid 2 mM samt L-prolin vid 10 mM. Blockerarna var rotenon vid 1 mikromolar (komplex I) och antimycin vid 1 mikrogram per ml (komplex III). Färgämnesdoserna var 0.5, 1 och 2 mikromolar, med 1 mikromolar som huvudkoncentration. Metoder och mätkurvor finns i artikeln i FEBS Letters.

Förbikoppling av komplex I fungerade. Rotenon sänkte den ADP-stimulerade respirationen från cirka 121 till cirka 2 nmol per minut per mg, och 1 mikromolar färgämne återställde den till cirka 21. Membranpotentialen återhämtade sig med pyruvat plus malat och med L-prolin.

Förbikoppling av komplex III fungerade inte. Antimycin sänkte respirationen till cirka 16, och färgämnet höjde den bara till cirka 20. Membranpotentialen återhämtade sig inte med något substrat, vid färgämnesdoser upp till 5 mikromolar. Peroxiddata pekade åt samma håll: enbart färgämnet ökade peroxidfrisättningen från en basal hastighet nära 76 pmol per minut per mg till ungefär 1170, 1460 och 1945 vid de tre doserna, men antimycin minskade denna färgämnesdrivna signal med cirka 25, 88 respektive 96 procent. Om reducerat färgämne reagerade direkt med syre borde blockering av komplex III inte dämpa signalen. Författarna drog slutsatsen att det reducerade färgämnet oxideras vid Qo-stället i komplex III, uppströms om antimycinblockeringen. Den korta slingan, i ord: elektrondonatorer till färgämnet, färgämnet till Qo, sedan vidare längs den normala vägen. Rotenon kringgås. Antimycin kringgås inte.

Studie två: partiell förbikoppling i tre arter, vid båda hämmarställena

Svab och kollegor breddade försöksupplägget. Hjärnmitokondrier från möss, råttor och marsvin isolerades med Percoll och analyserades vid samma 0.1 mg per ml, med pyruvat plus malat eller glutamat plus malat vid 5 mM vardera. De använde två blockerare av komplex III: antimycin A vid 0.3 mikromolar och myxotiazol vid 1 mikromolar. Färgämneskoncentrationen var 2 mikromolar i de flesta analyser och 0.5 i försöken med cytokrom c. Alla tre arterna, med matchade protokoll, finns i artikeln med öppen tillgång.

Båda blockeringarna kringgicks delvis, hos alla tre arterna. I musmitokondrier hämmade antimycin respirationen, och färgämnet ökade den med cirka 60 procent, från ungefär 37 till 59 nmol per minut per mg. Myxotiazol hämmade den med 88 procent, till cirka 4.5, och färgämnet femdubblade den till cirka 23. Membranpotentialen repolariserades delvis med båda hämmarna, vilket mättes med två färgämnen (safranin O och ratiometriskt TMRM) för att utesluta optiska artefakter.

Den här artikeln undersökte också elektronöverföringen direkt, vilket den första studien aldrig gjorde. Exogent acetylerat cytokrom c vid 25 mikromolar reducerades inte av energiserade mitokondrier, vare sig med eller utan hämmare, men tillsats av färgämnet drev reduktionen i båda fallen. I cellfri buffert reducerade NADH plus färgämnet cytokrom c med en hastighet som var proportionell mot NADH. Det längre språnget, i ord: reducerande ekvivalenter till färgämnet, färgämnet direkt till cytokrom c, komplex IV till syre. Den vägen hoppar över komplex III helt, så båda blockerarna kan kringgås.

Två ytterligare mätningar stöder den tolkningen. NAD(P)H-fluorescensen sjönk när färgämnet tillsattes till myxotiazolbehandlade mitokondrier, vilket innebär att reducerande ekvivalenter förbrukades via den nya vägen. Färgämnets absorbans vid 660 nm följde dessutom varje tillsats i tur och ordning, medan centrifugerade supernatanter visade att oxiderat färgämne anrikades mer än hundrafalt inne i energiserade mitokondrier och sedan lämnade dem när potentialen kollapsade. Även protonbalansen stämmer: när pumpstegen hoppas över återstår ungefär 2 protoner per elektronpar i stället för 10. Snabbare syreförbrukning med endast partiell repolarisering är därför vad man väntar sig av en verklig förbikoppling, inte ett belägg mot den.

Samma preparation gav svar som gör en ytlig läsning missvisande. Med hämmare plus färgämne sänkte ADP respirationen i stället för att öka den, och transportblockad stimulerade den i stället för att bromsa den, medan membranpotentialen fortfarande förändrades i de normala riktningarna. Enbart syreförbrukningen är missvisande i detta system.

Studie tre: leverstudien som undersökte komplex I och II, inte III

Lee och Boelsterli använde mitokondrier från muslever och odlade hepatocyter som skadats av efavirenz (komplex I, IC50 nära 30 mikromolar) och hydrazin, metaboliten av isoniazid (komplex II, IC50 nära 30 mikromolar). Färgämnet vid cirka 30 mikromolar återställde NADH-oxidation, membranpotential och ATP samtidigt som oxidanter och nekrotisk celldöd minskade. Artikeln i Redox Biology beskriver en modell där färgämnet bär elektroner förbi de skadade komplexen I och II.

Det resultatet ger ett etablerat sammanhang uppströms och säger ingenting om komplex III, eftersom ingenting blockerades där. Det kan varken bekräfta eller motbevisa någon av hjärnstudierna.

Matris över försöksbetingelser

Fyra skäl till att båda studierna av komplex III kan ha rätt för sina egna försöksupplägg

1. Blockerarna innebar inte samma ingrepp. Enbart antimycin vid 1 mikrogram per ml jämfört med antimycin vid 0.3 mikromolar plus en separat blockerare av Qo-stället. En färgämnesväg som för elektroner till Qo-stället misslyckas precis där en väg direkt till cytokrom c lyckas. Ett bindningsställe kan inte representera båda.

2. Färgämnesdos och tidpunkt skilde sig åt. Huvudkoncentrationerna var 1 respektive 2 mikromolar för ett ämne som genomgår redoxcykling och vars upptag och direkta reduktion av cytokrom c beror på koncentration och tid. Små dosskillnader tillsammans med olika mättidpunkter kan synliggöra olika delar av samma nätverk.

3. Preparationerna skilde sig åt. Isolering med digitonin respektive Percoll-gradient väljer ut överlappande men inte identiska mitokondriepopulationer. Proteinkoncentrationen var densamma, 0.1 mg per ml, så den variabeln faller bort, men det gör inte subpopulation och integritet. Artskillnaden kunde också avskrivas som misstänkt förklaring: den andra gruppen reproducerade sin fenotyp även i mus.

4. Substratförhållandena avgör vad färgämnet kan göra. Tre substratupplägg jämfört med NADH-kopplade substratpar. Tillgången på NADH och membranpotentialen avgör tillsammans hur snabbt färgämnet reduceras och hur det fördelas. En väg som kräver reducerat färgämne intill oxiderat cytokrom c är beroende av det valet.

Så läser du nästa påstående om förbikoppling

Fråga vilket komplex som blockerades, med vilken hämmare, vid vilket bindningsställe och vilken dos. Fråga efter färgämneskoncentrationen och när mätningen gjordes. Fråga efter vävnad, art, isoleringsmetod, proteinkoncentration och substrat. Fråga också om potential, respiration, redoxtillstånd och en direkt analys av elektronöverföringen ger samstämmiga resultat, eftersom enbart syreförbrukningen pekade åt fel håll mer än en gång här.

Den snäva sammanfattningen håller. Det råder enighet om att färgämnet kan kringgå komplex I. För komplex III visar musmitokondrier med antimycin vid 1 mikrogram per ml och färgämne vid 1 mikromolar ingen funktionell förbikoppling, medan tre arter med antimycin vid 0.3 mikromolar eller myxotiazol vid 1 mikromolar och färgämne vid 2 mikromolar visar partiell förbikoppling med direkt överföring från färgämnet till cytokrom c. Dessa påståenden kan samexistera. Allt därutöver är extrapolering.

Relaterad läsning håller det omstridda påståendet inom ramen för oomstridd kemi: hur metylenblått förflyttar elektroner om elektronöverföringen, experimenten med förbikoppling av komplex I om det etablerade fallet uppströms, mätningar av membranpotential och deras artefakter om varför två färgämnen behövdes samt laboratoriehantering av ämnen som genomgår redoxcykling om fallgroparna kring dosering och tidpunkter.