Metylenblått och ferroptos: järn, lipidperoxidation och celldöd

Ferroptos är celldöd genom membranskador. Fleromättade fetter i membranen oxideras i en kedjereaktion, membranet slutar fungera och cellen dör. Järn krävs för de kemiska reaktionerna. Den meningen sammanfattar hela begreppet, och allt i den här artikeln prövar någon del av det.

Frågan här är snävare: vad gör metylenblått med den kedjan i cellförsök, och vad visar resultatet egentligen? Det korta svaret är att metylenblått i nanomolära koncentrationer i två laboratoriestudier minskade mitokondriell lipidperoxidation och höll celler vid liv efter utlösande behandlingar som annars orsakar ferroptos. Det längre svaret är viktigare, eftersom varje länk i kedjan prövades med ett annat ingrepp, och varje ingrepp har sina begränsningar.

Ferroptos i ett stycke

En membranfosfolipid med en fleromättad fettsyrasvans har en svag punkt: väteatomer som lätt kan ryckas loss. När en radikal väl har ryckt loss en sådan atom binds syre till lipiden, en lipidperoxylradikal bildas och den radikalen rycker loss väte från nästa lipid. Reaktionen fortplantar sig längs membranet om inget stoppar den.

Den viktigaste bromsen är ett enzym som kallas GPX4, som använder glutation för att reducera lipidperoxider till ofarliga lipidalkoholer. Utlösande ämnen i laboratorieförsök angriper detta försvar på bestämda ställen. Erastin blockerar upptaget av cystin genom system xc-minus, vilket gör att cellen får brist på cystein för glutationsyntesen. Butioninsulfoximin blockerar glutationsyntesen direkt. RSL3 hämmar själva GPX4. Alla tre gör att peroxider inte avlägsnas, men de verkar i olika steg, så ett resultat med ett utlösande ämne kan inte automatiskt generaliseras till de andra.

Ferroptos skiljer sig från apoptos genom de egenskaper som definierar den. Det finns ingen kaspaskaskad och inga apoptotiska kroppar. Järnkelatorer som deferoxamin och radikalfångande ämnen som ferrostatin-1 hämmar den, vilket är det praktiska test som forskare använder för att klassificera celldöd som ferroptotisk snarare än enbart nekrotisk. Den bredare bilden av reglerade celldödsvägar sätter denna skillnad i ett sammanhang, och cellernas hantering av labilt järn förklarar varför kelering är en så avgörande kontroll.

Mitokondriernas roll och varför den var omstridd

Tidiga arbeten rapporterade att celler utan mitokondriellt DNA ändå genomgår ferroptos, vilket antydde att mitokondrier inte är nödvändiga. Senare arbeten visade att en minskning av antalet mitokondrier, eller blockering av cellandningen, kan hämma ferroptos orsakad av cysteinbrist men inte av direkt GPX4-hämning. Båda resultaten kan stämma om mitokondriernas bidrag beror på det utlösande ämnet, celltypen och var den avgörande peroxidationen sker.

Studien som ligger till grund för den här artikeln närmade sig frågan med en sond som är specifik för ett cellkompartment. MitoCLox är en mitokondrieriktad version av en reporter för lipidperoxidation: dess fluorescens förändras när den möter lipidperoxylradikaler inne i mitokondrierna. I fibroblaster som behandlats med erastin uppträdde oxidation av den mitokondriella sonden i fortfarande levande celler före celldöden, och den varierade mellan cellerna i populationen. Den tidsföljden är viktig. Peroxidation som föregår celldöd är en möjlig orsak. Peroxidation som bara mäts i döda celler är en restprodukt. En kompletterande guide till analyser av lipidperoxidation och vad varje sond visar tar upp varför sondens placering avgör vad en signal betyder.

Samma mönster uppträdde i en andra modell. Fibroblaster från en patient med Lebers hereditära optikusneuropati, som har en mutation i komplex I och högre oxidativ stress redan från början, dog genom ferroptos när glutation tömdes ut, medan kontrollfibroblasterna stod emot. Återigen kom oxidationen av den mitokondriella sonden först. Detaljerna finns i fibroblaststudien om mitokondriell lipidperoxidation vid ferroptos.

Vad metylenblått förändrade i dessa försök

Metylenblått är en redoxbärare. Dess oxiderade form tar emot elektroner från NADH-kopplade reaktioner vid komplex I, och dess reducerade form lämnar dem till cytokrom c, som förser komplex IV med elektroner. Det skapar en partiell förbikoppling av den del av kedjan där elektroner normalt läcker till syre och bildar superoxid. Läsare som vill ha en fullständig bild av elektronöverföringen bör börja med hur metylenblått transporterar elektroner genom mitokondrier.

I erastinbehandlade lungfibroblaster bevarade metylenblått vid 250 nanomolar cellernas livsduglighet enligt en mätning av cellöverlevnad, liksom de mitokondrieriktade antioxidanterna SkQ1 och MitoTEMPO. Kontrollerna avgränsar slutsatsen. Ferrostatin-1, alfa-tokoferol och deferoxamin skyddade också, vilket bekräftar att celldöden var ferroptotisk. SkQ1-analogen utan en antioxidantgrupp skyddade inte, vilket pekar på redoxreaktioner snarare än ospecifik ansamling. Skyddet avtog över ungefär 200 nanomolar SkQ1, vilket är förenligt med kinonantioxidanters kända prooxidativa beteende vid högre nivåer. Metylenblått har samma dubbla koncentrationsberoende beteende: skyddande vid låga nanomolära nivåer i dessa odlingsskålar, men med förmåga att bilda väteperoxid genom redoxcykling vid högre koncentrationer eller stark belysning. Den här typen av koncentrationsberoende sammanhang behandlas i reaktiva syreföreningar i mitokondrier.

Försöken med isolerade mitokondrier skilde sedan mellan ROS-källorna. I närvaro av tvåvärt järn stimulerade substrat som tillför elektroner till komplex I, tillsammans med rotenon, oxidationen av sonden. Rotenon blockerar nedströms om flavinstället, så elektronbärare uppströms förblir reducerade och läcker elektroner till syre från det matrixvända flavinet. Substrat som tillför elektroner till komplex III, tillsammans med antimycin A, gav upphov till stora mängder väteperoxid men drev inte lipidperoxidation. Samma övergripande ROS-signal, olika plats, olika utfall. Både SkQ1 och metylenblått hämmade den komplex I-drivna peroxidationen utan att hämma själva väteperoxidproduktionen, vilket placerar deras verkan efter ROS-bildningen, vid lipidperoxidationssteget.

Järnöverbelastningsförsöken och ledtråden från lipofuscin

En andra studie undersökte frågan från järnets sida. H9c2-kardiomyocyter som exponerades för järn(III)ammoniumcitrat i submillimolära koncentrationer utvecklade mitokondriella ROS, mitokondriell lipidperoxidation och därefter ferroptos, följt av ansamling av ett lipofuscinliknande pigment inom 24 timmar. Lipofuscin är den autofluorescerande, järnhaltiga rest av oxiderade lipider och proteiner som ansamlas med åldern, och dess snabba uppkomst här kopplar akut järndriven peroxidation till en klassisk åldringsmarkör. Både metylenblått i nanomolära koncentrationer och SkQ1 förhindrade peroxidationen, celldöden och pigmentansamlingen. Isolerade hjärtmitokondrier bekräftade mönstret: rotenon tillsammans med tvåvärt järn drev peroxidation och en pigmentliknande signal, och båda ämnena blockerade detta. Hela förloppet rapporteras i studien av järnöverbelastning i H9c2-kardiomyocyter. Pigmentdelen av berättelsen hör ihop med lipofuscin och cellulära åldringsmarkörer.

Vad analyser av cellöverlevnad inte visar

En mätning av livsduglighet, som CellTiterBlue, visar hur många celler i en odlingsskål som förblir metaboliskt aktiva efter behandling med ett utlösande ämne och ett potentiellt skyddande ämne. Det är ett test av en mekanism i ett definierat system. Det är inte ett behandlingsresultat. Inget av dessa försök gav ett ämne till en patient, mätte ett sjukdomsrelaterat utfall eller fastställde ett terapeutiskt fönster i en kropp.

Fyra begränsningar behöver anges uttryckligen. För det första är urvalet av celltyper snävt: transformerade lungfibroblaster, primära hudfibroblaster inklusive en cellinje med mitokondriell sjukdom, och en kardiomyocytcellinje från råtta, samt isolerade hjärtmitokondrier från råtta. Känsligheten varierade mellan cellinjerna, och LHON-linjen hade valts för sin ovanligt höga sårbarhet. För det andra är de utlösande behandlingarna extrema laboratoriebetingelser: fullständig blockering av transport eller syntes, och järnbelastningar som ingen vävnad skulle utsättas för akut. För det tredje kan en koncentration inte översättas till en dos genom multiplikation. Nanomolära koncentrationer i odlingsmedium är inte en dos för människor, och metylenblåtts fördelning, reduktion till dess färglösa form i blod och vävnad, ljusexponering och membranpotential påverkar alla övergången från en odlingsskål till en människa. För det fjärde rapporterar sonderna bara om sitt eget kompartment. Oxidation av MitoCLox visar att mitokondriella lipidradikaler bildades; den visar inte att bristningen av plasmamembranet, den sannolika slutliga händelsen, förhindrades direkt snarare än undveks genom en effekt uppströms.

Den välgrundade slutsatsen är alltså denna: i dessa modeller driver ROS från komplex I tillsammans med järn mitokondriell lipidperoxidation som föregår ferroptos, och metylenblått i låga koncentrationer bryter den delen av förloppet. Allt utöver den delen kräver andra försök i djur och därefter i människor.