Varför absorptionen hos metylenblått ändras med koncentrationen

Ta en flaska med stamlösning av metylenblått och häll upp två glas. Fyll det första med stamlösningen och det andra med en tiofaldig spädning. Det andra glaset är blekare, som väntat. Tittar du noga ser du att något annat också har förändrats. Nyansen har skiftat. Den ena lösningen drar åt klart himmelsblått och den andra åt blått med en violett ton. Spädningen gjorde mer än att minska intensiteten. Den ändrade vilken kemisk form som står för merparten av absorptionen.

Principen bakom skiftet är enkel. Löst metylenblått förekommer inte bara i en form. Den enskilda färgämneskatjonen, kallad monomeren, kan staplas med sin plana yta mot en andra katjon och bilda en dimer, och dimerer kan växa till större aggregat. Varje form har sitt eget absorptionsspektrum. Det en spektrofotometer visar är summan för den blandning som finns i kyvetten under de aktuella förhållandena. Ändra blandningen, så ändras spektrumet, även när den totala färgämneshalten följer ett enkelt spädningsförhållande.

Monomerer och dimerer absorberar olika

Föreställ dig monomeren som ett platt kort med en positiv laddning fördelad över ringsystemet. Två sådana kort kan ligga med de plana ytorna mot varandra. De positiva laddningarna stöter bort varandra, men de plana aromatiska ytorna attraherar varandra genom staplingsinteraktioner, och omgivande vatten och motjoner skärmar av repulsionen. Resultatet är ett bundet par med gemensamma elektroniska tillstånd. Dess tillåtna övergångar ligger vid högre energi än monomerens övergång, så dimerbandet uppträder vid kortare våglängd än monomerbandet. Större aggregat bidrar med en skuldra längre mot den blå sidan.

Vid mycket låg koncentration i rent vatten dominerar monomerer, och bandet vid längre våglängd dominerar. När totalkoncentrationen stiger utgör den parade formen en allt större andel, och bandet vid kortare våglängd växer i förhållande till det första. Kvoten mellan de två banden visar därför blandningens sammansättning, inte totalkoncentrationen direkt. En mätning vid en enda våglängd kan inte skilja de två åt utan ett antagande om vilken form som finns.

Det är därför referensspektra alltid måste anges tillsammans med mätförhållandena. Spektralreferensen för metylenblått redovisar bandpositioner tillsammans med lösningsmedel, saltbakgrund, pH, temperatur och koncentrationsintervall som gav upphov till dem. Anger man en topp utan dessa förhållanden är värdet otillräckligt specificerat. Två laboratorier kan båda ha rätt om olika spektra för samma färgämne, eftersom de mätte olika blandningar.

Vad som förskjuter jämvikten

Koncentrationen är den viktigaste styrfaktorn. Dimerbildning kräver att två monomerer möts, så dimerandelen ökar snabbare än linjärt med den totala färgämneshalten. Rapporterade dimeriseringskonstanter i vatten ligger i storleksordningen tusentals per molar nära rumstemperatur, så dimerandelen ökar brant inom det mikromolära området. En omfattande global anpassning från mikromolära till millimolära färgämneskoncentrationer visade ett bidrag från tetramerer som skilde sig från noll redan under 34 mikromolar. Det är en varning för att förlita sig på en strikt modell med två former vid koncentrationer på tiotals mikromolar. De exakta andelarna beror på mediet, och därför beskriver den här artikeln riktningar snarare än en universell omräkningstabell.

Salt är den andra styrfaktorn. Lösta joner skärmar av repulsionen mellan två katjoner, så tillsatt natriumklorid och liknande elektrolyter förskjuter blandningen mot dimerer och aggregat vid samma färgämneskoncentration. Effekten syns i studier av aggregation av metylenblått i saltlösningar och vattenbaserade medier, där färgämneskoncentrationer från ungefär 1 mikromolar till 3.4 millimolar mättes vid natriumkloridkoncentrationer från 0 till 0.15 molar. I den anpassningen nådde tetramerandelen ungefär 0.93 vid kombinationen hög färgämneshalt och hög salthalt. Ett spektrum uppmätt i vatten och ett uppmätt i fysiologisk koksaltlösning är därför inte utbytbara referenser.

Temperaturen verkar i motsatt riktning. Stapling frigör bundet vatten och motverkas av termisk rörelse, så uppvärmning av en lösning får vanligtvis en del dimerer att dissociera till monomerer igen, medan kylning gynnar association. Den anpassade dissociationsentalpin är negativ, ungefär minus 30 kilojoule per mol inom intervallet 282 till 333 kelvin, vilket bekräftar exoterm association. Ett kallt prov som mäts direkt efter kylförvaring kan verka mer aggregerat än samma prov efter att det har fått nå rumstemperatur.

Lösningsmedlet sätter grundförutsättningarna. Vatten, med sin starka hydrofoba effekt, gynnar stapling av plana färgämneskatjoner. Alkoholer som etanol och metanol solvatiserar ringarna bättre och bryter upp aggregat, så samma färgämneskoncentration framstår som mer monomerisk i etanol än i vatten. Aprotiska hjälplösningsmedel gör samma sak: i blandningar av vatten och DMSO vid 293 kelvin hämmade tillsatt DMSO dimerisering, vilket pekar på att vattnets struktur driver staplingen. Tensider kräver försiktighet åt båda hållen. Över sin kritiska micellkoncentration kan de bilda miceller som solubiliserar monomerer var för sig och återställer ett monomerliknande spektrum. Under den punkten kan en motsatt laddad tensid i stället främja stapling: vid 100 mikromolar färgämne nådde SDS-driven polymerisering sin topp nära 4 millimolar SDS, ungefär halva micellkoncentrationen, innan en omfördelning skedde vid högre tensidhalter. Arbeten om hur färgämne–lösningsmedel-interaktioner och organiserade medier påverkar metylenblåtts spektra visar hur starkt den omedelbara molekylära omgivningen, inte bara koncentrationen i bulklösningen, bestämmer de observerade banden.

pH har främst betydelse vid ytterligheterna. Inom det nära neutrala området som används i de flesta laboratoriearbeten finns metylenblått kvar i sin välbekanta katjoniska blå form, och aggregation dominerar spektralförändringarna. Stark syra eller bas, redoxkemi som ger den färglösa leukoformen och bindning till proteiner eller partiklar tillför alla tillstånd utöver monomer–dimer-paret. När ett spektrum ändras efter tillsats av en buffert bör du kontrollera buffertens innehåll av salt och bindande komponenter innan du tillskriver allt enbart pH. Referensen för kemi och protonering håller dessa frågor om kemisk identitet åtskilda från aggregationsfrågan som behandlas här.

Varför Beer-Lamberts räta linje böjs

Beer-Lamberts lag säger att absorbansen är lika med absorptiviteten gånger koncentrationen gånger ljusvägens längd. Det är en räknelag. Den förutsätter att de objekt som räknas förblir identiska när deras antal ändras: en absorberande form, ett fast spektrum, ingen koncentrationsberoende kemi, monokromatiskt mätljus, ingen spridning eller återemission och ljus som faktiskt färdas längs den angivna vägen.

Aggregation bryter mot det första antagandet. Formellt förblir den totala absorbansen en summa över de olika formerna: ljusvägens längd gånger varje forms absorptivitet gånger dess egen koncentration. Varje form följer lagen. Blandningen gör det inte, eftersom de enskilda formernas koncentrationer är icke-linjära funktioner av den totala färgämneshalten. En kalibreringskurva med absorbansen vid monomerbandet mot den totala färgämneshalten börjar därför rakt vid låg koncentration och böjs nedåt när koncentrationen stiger, eftersom varje tillskott ger proportionellt mindre monomer. En kurva som mäts vid dimerbandet böjs åt motsatt håll. Aggregationsstudier pekar ut just denna mekanism som orsaken till de observerade avvikelserna från Lambert-Beers lag. Att anpassa en rät linje genom det böjda området och extrapolera den är standardfelet. Linjen är giltig endast inom det intervall och i den matris där den togs fram.

Spädning skapar en närbesläktad fallgrop. Att späda en koncentrerad stamlösning för att komma inom instrumentets mätområde bevarar inte förhållandet mellan formerna. Den spädda lösningen i kyvetten ställer in en ny jämvikt mot monomer, så dess spektrum beskriver det spädda provet korrekt men stamlösningen felaktigt. Att räkna tillbaka stamlösningens spektrum genom att skala upp absorbansvärdena ger en korrekt uppskattning av totalhalten endast om kalibreringen redan tar hänsyn till förskjutningen. Det återställer aldrig den ursprungliga bandformen. Den som jämför ett koncentrats spektrum med en utspädd referens jämför två olika blandningar.

Ljusvägens längd är en del av resultatet

Absorbansen är proportionell mot den sträcka ljuset färdas genom provet. En 10 mm kyvett ger tio gånger så hög absorbans som en 1 mm kyvett med samma lösning. Den skalningen är exakt endast för samma lösning, och aggregation gör det förbehållet avgörande.

I praktiken är ljusvägens längd ett verktyg för att hålla sig inom det giltiga området. En lång ljusväg ger känslighet för utspädda, huvudsakligen monomeriska lösningar. En kort ljusväg håller ett koncentrerat prov inom mätområdet utan ett stort spädningssteg som skulle ändra jämvikten. Aggregationsstudien bakom siffrorna ovan gjorde precis detta: 1 centimeter långa kyvetter för 1.1 till 34 mikromolar färgämne och 0.01 centimeter långa kyvetter för 94 mikromolar till 3.4 millimolar. Mätplattformar för mikrovolymer och plattläsare tillför egen geometri, med korta och ibland variabla ljusvägar samt ytor där katjoniskt färgämne kan adsorberas. Ange ljusvägens längd tillsammans med värdet, på samma sätt som spektralreferensen anger lösningsmedel och salt. En absorbans utan ljusvägens längd är inte ett resultat. Det är ett rykte.

Mätdisciplinen följer av mekanismen. Låt proverna nå samma temperatur före mätning. Använd samma kyvettyp och orientering, matchade blankprov med samma salt- och buffertbakgrund samt rena glaskärl, eftersom metylenblått adsorberas till glas och plast och en färgad kyvett bär på ett minne av det senaste koncentrerade provet. Mät snarast efter beredning när aggregationskinetiken har betydelse, och bygg varje kalibreringskurva i samma matris och med samma ljusvägslängd som de okända proverna. Vid visuella kontroller bör du komma ihåg att ögat är en dålig spektrometer. Huruvida lösningens färg kan fastställa renhet är en separat fråga med ett negativt svar, och nyansförskjutningar från aggregation är en av orsakerna.

Ett diagram att ha bredvid instrumentet

Figuren nedan sammanfattar artikeln i en enda referens att ha vid laboratoriebänken. Tre lösningar innehåller samma färgämne men har olika totalkoncentration och saltbakgrund. Deras schematiska spektra visar hur monomerbandet vid längre våglängd förlorar andel till dimerbandet vid kortare våglängd när staplingen ökar. Förhållandena anges i figuren eftersom kurvorna inte kan återanvändas utan dem. För uppmätta bandpositioner under angivna förhållanden, använd spektralreferensen. För hur färgämnet kommer in i celler när det väl är i lösning, se cellinträde genom reduktion och fördelning. För hur ljusdos och geometri ytterligare påverkar fotokemiska mätresultat, se ljusexponering och mätgeometri.

Regeln att ta med sig har två delar. Spektrumet identifierar blandningen som finns i kyvetten under de angivna förhållandena. Endast en kalibrering som tagits fram under samma förhållanden kan omvandla en absorbans till en totalkoncentration.