Alternativ till metylenblått för mikroskopi

För ett enkelt bakterieutstryk kan kristallviolett ersätta metylenblått när syftet är att se cellernas form. För levande celler kan ett bättre alternativ vara faskontrast helt utan färgning. Valet beror på vilken observation du behöver göra.

Anta att två personer undersöker samma bakteriekultur. Den ena vill skilja stavformade från runda celler. Den andra vill veta om en behandling har dödat bakterierna. En färgning som ger den första personen en tydlig bild kanske inte ger den andra något användbart svar.

Innan du väljer ett substitut, slutför den här meningen: ”Jag behöver observera ___ i ___, och cellerna måste / behöver inte förbli levande.” Den meningen definierar vilken uppgift färgningen måste utföra.

Börja med provet och frågan

Avgör först om cellerna måste förbli levande och identifiera sedan den egenskap du behöver observera:

Cellerna måste förbli levande: för rörelse eller form, överväg ofärgad faskontrast eller DIC; för nukleärt DNA, överväg Hoechst 33342 med fluorescens; för membranintegritet, välj en validerad analys såsom SYTO 9 med propidiumjodid.
Cellerna behöver inte förbli levande: för bakteriell morfologi, överväg enkel färgning med kristallviolett eller negativ färgning med nigrosin; för Gramreaktion, använd den fullständiga Gramfärgningsmetoden; för nukleärt DNA i fixerade celler, överväg DAPI-fluorescens.

Använd den här tabellen för att jämföra begränsningarna i varje alternativ. Det här är metodval, inte instruktioner för att byta ut flaskor inom ett befintligt protokoll.

Vad du behöver observera	Prov och utrustning	Möjligt alternativ	Huvudsaklig begränsning
Bakteriers form och arrangemang	Preparat med bakterieutstryk; ljusfält	Enkel färgning med kristallviolett	Visar morfologi; fastställer inte Gramreaktion eller viabilitet.
Cellkonturer mot mörk bakgrund	Bakteriologiskt preparat; ljusfält	Negativ färgning med nigrosin	Preparering och formulering spelar roll; en ofärgad cell är inte nödvändigtvis levande.
Gramreaktion	Preparat med bakterieutstryk; ljusfält	Fullständig Gramfärgningsmetod	Kräver hela reagenssekvensen och kontroller.
Rörelse eller förändringar i levande celler	Kompatibelt våtpreparat; faskontrast eller DIC	Ingen färgning	Kräver lämplig optik; kontrast identifierar inte en molekyl.
Nukleärt DNA	Fixerade celler; fluorescens	DAPI	Kräver kompatibla excitations- och emissionsfilter.
Nukleärt DNA i levande celler	Levande celler; fluorescens	Hoechst 33342	Cellinträngning fastställer inte att avbildningsförhållandena är ofarliga.
Bakteriell membranintegritet	Icke-fixerade bakterier; fluorescens	SYTO 9 med propidiumjodid	Membranfärgning är ett indirekt mått på viabilitet.

För ett enkelt utstryk, byt metod med omsorg

Kristallviolett är ett praktiskt alternativ när uppgiften är att få en enfärgad bild av bakteriell morfologi. FDA:s Bacteriological Analytical Manual listar två formuleringar av kristallviolett som lämpar sig för enkel färgning. Använd en dokumenterad formulering och dess beredningsmetod; enbart färgämnets namn specificerar inte ett bruksfärdigt reagens.

Kristallviolett används även vid Gramfärgning, men det innebär inte att enkel färgning med kristallviolett är en Gramfärgning. I ASM:s protokoll för Gramfärgning beror det differentiella resultatet på att kristallviolett, jod, avfärgning och motfärgning verkar i följd. Om dessa steg utelämnas förändras vad bilden kan fastställa. Se enkel färgning jämfört med Gramfärgning för den skillnaden.

Nigrosin ger ett annat sätt att framhäva konturer: bakgrunden mörkas medan bakteriecellerna förblir jämförelsevis ljusa. Det finns en viktig detalj i Mercks instruktioner för nigrosin som en generell lista över substitut kan missa. Den angivna bruksformuleringen innehåller formaldehyd. Du kan därför inte dra slutsatsen att metoden är kompatibel med levande celler enbart utifrån orden ”negativ färgning”, även om cellerna själva ser ofärgade ut. Kontrollera den fullständiga formuleringen och provberedningen.

För levande prover, överväg att ändra optiken

Om du vill observera hur celler rör sig eller delar sig kan ytterligare ett färgämne komplicera observationen. Som Nikon förklarar i sin guide om kontrast i transparenta prover gör faskontrast och differentiell interferenskontrast, eller DIC, prover synliga genom skillnader i deras optiska egenskaper. De kan synliggöra levande, ofärgade celler, förutsatt att mikroskopet har de komponenter som krävs.

Detta val bevarar ett ofärgat preparat, men förändrar vilken information som är tillgänglig. Du kan följa en gräns eller en rörelse utan att veta vilken molekyl som gav upphov till kontrasten. Om frågan gäller molekylär lokalisering bör du i stället välja en lämplig märkningsmetod.

För nukleärt DNA skiljer Invitrogens jämförelse av DAPI- och Hoechst-färgningar mellan DAPI:s vanliga användning med fixerade celler och det mer cellpermeabla Hoechst 33342, som föredras för märkning av levande celler. Båda kräver fluorescensutrustning. Ingen av dem är en direkt ersättning för en färgad ljusfältsfärgning.

Behandla exponering för färgämne och belysning som experimentella förhållanden. Jämför färgade och ofärgade preparat när cellernas beteende är det du mäter.

En röd cell är inte automatiskt en död cell

SYTO 9 och propidiumjodid används ofta tillsammans för att bedöma bakteriell membranintegritet. BacLight-manualen förknippar intakta membran med grön färgning och skadade membran med röd färgning. Den tolkningen behöver valideras för det aktuella provet.

En studie från 2019 av Rosenberg och kollegor illustrerar problemet. I 24-timmars E. coli-biofilmer på glas i fosfatbuffrad saltlösning framstod omkring 96% av cellerna som propidiumjodidpositiva in situ. Ändå uppskattade författarna att 82% var odlingsbara efter insamling. Konfokala bilder visade celler med grönt inre under rödfärgat material, vilket pekade på extracellulära nukleinsyror som en orsak till den missvisande signalen.

Dessa procenttal beskriver olika mätningar på studiens preparat, inte en universell korrigeringsfaktor. Den användbara lärdomen är att kontrollera vad som gav upphov till signalen. I en biofilm kan ett nukleinsyrafärgämne detektera material utanför cellerna såväl som inuti skadade celler. För en slutsats om viabilitet rekommenderar forskarna kompletterande mätningar, såsom odling eller metabolisk aktivitet, samtidigt som de konstaterar att varje metod har begränsningar.

Kontrollera vad alternativet faktiskt innehåller

En alternativ färgningsmetod kan fortfarande innehålla metylenblått. Giemsa är ett exempel: Merck beskriver sin produkt som en azure-eosin-methylene-blue solution, avsedd för tillämpningar som bland annat blod- och benmärgsutstryk. Det kan vara en annan metod för ett annat prov, men den uppfyller inte ett krav på att utesluta metylenblått.

Om uteslutning av en förening är en del av experimentet bör du kontrollera reagensets identitet och formulering innan du jämför bilder. Guiden om methyl blue, methylene blue och färgämnen med liknande namn behandlar skillnader i namngivning.

Verifiera bytet innan du använder resultatet

För en ny metod, gör en mindre jämförelse med representativa prover och en lämplig kontroll. Håll mikroskopinställningarna jämförbara där det är möjligt. Dokumentera reagensformulering, provberedning, exponering och avbildningsförhållanden så att en bild som ser bättre ut kan undersökas i stället för att enbart föredras.

Bedöm resultatet utifrån den ursprungliga frågan. För morfologi, bedöm om cellgränser och arrangemang fortfarande går att tolka. För nukleär märkning, bedöm signalens lokalisering och bakgrunden. För viabilitet, kräv evidens utöver en tilltalande färgseparation. Den bredare guiden om färgning med metylenblått och laboratorietillämpningar förklarar hur observationen och prepareringen hänger samman.

Välj det alternativ som bevarar den mätning du behöver. Färg är bara en egenskap hos den resulterande bilden.