Novo metilensko plavo i bojenje retikulocita: zasebna boja i metoda za žive ćelije

Student priprema brojanje retikulocita, naručuje metilensko plavo, meša ga sa krvlju i ne vidi gotovo ništa. Kolega koristi bočicu sa oznakom novo metilensko plavo i dobija jasno izražene plave filamente u delu eritrocita. Prvi student pretpostavlja da je sadržaj druge bočice svežiji ili koncentrovaniji. Nije ni jedno ni drugo. U njoj se nalazi drugačiji molekul.

Ova pojmovna greška stoji iza većine nedoumica u ovoj oblasti. Naziv sugeriše da je novo metilensko plavo poboljšana serija metilenskog plavog. Hemija govori drugačije. Novo metilensko plavo N je zasebna fenotiazinska boja sa sopstvenim brojem u indeksu boja Colour Index, sopstvenim rasporedom supstituenata i sopstvenom standardizovanom ulogom u hematologiji. Kada ta razlika postane jasna, ostatak metode — zašto ćelije moraju biti žive tokom bojenja, šta se računa kao retikulocit, gde se uklapaju Heinzova tela i kada u priču ulazi briljantno krezil plavo — postaje jednostavan.

Kratak odgovor

Novo metilensko plavo N, hematološki reagens, uglavnom se identifikuje kao Basic Blue 24 u PubChem zapisu za novo metilensko plavo, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, formula C18H22ClN3S. Obično metilensko plavo je metiltioninijum-hlorid, Basic Blue 9, u svom PubChem zapisu, C.I. 52015, CAS 61-73-4, formula C16H18ClN3S. Strukturno, novo metilensko plavo ima dve metil-grupe na prstenu i etilamino bočne lance na mestima gde metilensko plavo ima dimetilamino grupe. Ta razlika menja ponašanje pri bojenju. Hematološka literatura opisuje obično metilensko plavo kao relativno slabu boju za retikulocite, a novo metilensko plavo kao boju koja daje intenzivnije i ujednačenije bojenje; ovo poređenje sažeto je u ScienceDirect pregledu o novom metilenskom plavom.

Da, novo metilensko plavo je supravitalna boja. Supravitalno bojenje znači bojenje živih ćelija nakon uklanjanja iz tela, a pre fiksacije, kako je definisano u NCBI pregledu principa supravitalnog bojenja. I novo metilensko plavo i briljantno krezil plavo pripadaju ovoj kategoriji, a CLSI standard za retikulocite izričito obuhvata novo metilensko plavo kao supravitalnu boju. Studenti ovo ponekad svrstavaju uz bojenje fiksiranih razmaza po Romanovskom. Takav način razmišljanja ovde ne funkcioniše. Ako prvo fiksirate ćelije, metoda prestaje da deluje.

Za čitaoce koji prate slične nazive boja, članak metil plavo naspram metilenskog plavog obrađuje drugačiju i širu zabunu između anjonske triarilmetanske boje i katjonske porodice fenotiazina. Pregled laboratorijskog bojenja smešta supravitalni rad u kontekst metoda za fiksirane razmaze, a vodič za morfologiju krvnih ćelija pokazuje gde se procena retikulocita uklapa u širu diferencijalnu analizu.

Jedna napomena pri pregledu kataloga: postoji zaseban oblik novog metilenskog plavog kao dvostruke soli sa cink-hloridom, pod oznakom CAS 6586-05-6. Zato u odeljku o metodama treba navesti oblik soli i dobavljača, a ne samo uobičajeni naziv.

Šta supravitalno bojenje zapravo radi

Retikulocit je mlad eritrocit koji je izgubio jedro, ali zadržava preostalu ribozomsku RNK. U neobojenom vlažnom preparatu ta RNK nije vidljiva. Supravitalna boja ulazi u živu ćeliju i taloži ili grupiše tu RNK u plave granule i filamente, odnosno retikulofilamentozni materijal vidljiv pri posmatranju sa uljnom imerzijom. Mreža je, dakle, proizvod bojenja, a ne unapred formiran skelet koji čeka boju. Zato su promenljive u protokolu — koncentracija boje, pufer, odnos krvi i boje, temperatura i vreme — jednako važne kao naziv boje.

Praktična posledica je strog redosled postupaka: prvo pomešati krv sa antikoagulansom i boju, inkubirati, a zatim napraviti razmaze i pregledati ih nefiksirane i bez kontrastnog bojenja. Fiksacija pre bojenja ili kontrastno bojenje koje zaklanja slabo obojene filamente uništava informacije od kojih brojanje zavisi.

Praktičan protokol za retikulocite sa novim metilenskim plavim

Ne postoji jedna univerzalna formulacija, zato navedite onu koja je korišćena. Tri dokumentovane varijante pokazuju raspon mogućnosti.

Klasičan postupak po Brecheru koristi približno 0.5 procenata novog metilenskog plavog sa kalijum-oksalatom, pomešanog u jednakim zapreminama sa dobro izmešanom krvlju sa EDTA, uz inkubaciju od oko 10 do 15 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ponovnog blagog mešanja pripremaju se tanki klinasti razmazi, suše na vazduhu i pregledaju nefiksirani pod uljnim imerzionim objektivom 100x. NCBI postupak za brojanje retikulocita opisuje ovaj tok rada i okvir za brojanje koji se pri tome koristi.

Varijanta po Dacieju i Lewisu koristi 1.0 procenat novog metilenskog plavog u citratnom fiziološkom rastvoru, pomešanog sa 2 do 4 zapremine krvi i držanog na 37 C tokom 15 do 20 minuta pre izrade razmaza. U nedavnoj primeni usaglašavanja postupka CLSI H44 korišćen je razblaženiji rastvor od 0.1 procenata u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatima pri pH 7.4, uz inkubaciju na 20 C tokom 10 minuta i bez fiksacije, kako je navedeno u studiji o usaglašavanju bojenja novim metilenskim plavim iz 2026. godine.

Pravila brojanja zajednička su svim varijantama. Ćeliju računajte kao retikulocit kada sadrži najmanje dve zasebne plavo obojene granule ili segmenta filamenata, čime se isključuju izolovane naslage boje. U rutinskom radu prebrojte najmanje 1,000 eritrocita i izrazite retikulocite u procentima. Pri niskim procentima statistika zahteva više ćelija. Pregled metodologije CLSI H44 navodi da je pri približno 1 procentu retikulocita potrebno oko 4,400 ćelija da bi se varijacija brojanja svela na 5 procenata, u pregledu CLSI H44 na sajtu De Gruyter. Millerov okularni disk čini brojanje velikog broja ćelija praktičnim. Filtrirajte boju ili pripremite svež rastvor, jer talog oponaša granularne inkluzije.

Heinzova tela u istom preparatu

Isti supravitalni razmaz može prikazati i Heinzova tela, koja predstavljaju agregate oksidovanog i denaturisanog hemoglobina, a ne preostalu RNK. U preparatima sa novim metilenskim plavim pojavljuju se kao okrugla tela, često pojedinačna i blizu membrane, obojena svetlije plavo od retikulofilamentoznog materijala. Slabo se očuvaju nakon fiksacije i kontrastnog bojenja, zato pregledajte nefiksirani razmaz. U nedavnom protokolu, koji je koristio 20 mikrolitara krvi sa EDTA i 20 mikrolitara 1-procentnog novog metilenskog plavog uz 15 minuta inkubacije, određen je broj ćelija sa Heinzovim telima među 250 eritrocita, u studiji na PMC-u koja opisuje taj postupak.

Dve razlike sprečavaju pogrešno tumačenje. Prvo, metil ljubičasto i kristal ljubičasto boje Heinzova tela intenzivnije od novog metilenskog plavog, kako je navedeno u ScienceDirect pregledu o Heinzovim telima. Novo metilensko plavo je praktičan izbor kada se retikulociti i Heinzova tela procenjuju zajedno, ali nije najintenzivnija boja namenjena isključivo Heinzovim telima. Drugo, HbH inkluzije kod nosilaca alfa-talasemije nakon supravitalnog bojenja stvaraju brojne sitne tačke širom ćelije, dok su klasična Heinzova tela malobrojnija, veća i često povezana sa membranom. Naslage boje su treći izvor zabune: nalaze se izvan fokalne ravni ćelija i razlikuju se od jednog vidnog polja do drugog.

Briljantno krezil plavo naspram novog metilenskog plavog

Obe boje su supravitalne boje za retikulocite, ali standardizacija daje prednost jednoj od njih. Metoda za retikulocite CLSI H44-A2, razvijena zajedno sa Međunarodnim savetom za standardizaciju u hematologiji i navedena na stranici standarda CLSI H44, određuje bojenje krvi sa EDTA novim metilenskim plavim kao ručnu uporednu metodu. Klasična hematološka nastava saglasna je u pogledu izgleda: novo metilensko plavo daje intenzivnije i ujednačenije bojenje filamenata, dok briljantno krezil plavo pokazuje veće razlike između serija i uzoraka.

Taj status zahteva ogradu. ICSH smernica za procenu analizatora prihvata ručnu mikroskopiju sa novim metilenskim plavim kao referentni pristup poređenju, ali je opisuje kao subjektivnu i relativno nepreciznu, uz prednost referentnih postupaka protočne citometrije tamo gde su dostupni. Poređenje 100 uzoraka iz 2022. godine pokazalo je manje sistematsko odstupanje u odnosu na korišćeni analizator sa briljantnim krezil plavim nego sa novim metilenskim plavim, što je objavljeno u poređenju metoda bojenja na PMC-u. Utemeljen sažetak za studente glasi: koristite novo metilensko plavo kao standardizovanu ručnu metodu za poređenje, proverite svaku lokalnu metodu sa briljantnim krezil plavim u odnosu na nju ili na automatizovanu metodu i u oba slučaja očekujte veće rasipanje rezultata pri ručnoj mikroskopiji. Starija literatura o standardizaciji takođe je zagovarala prečišćeni Azure B kao hemijski čistiju alternativu zbog varijacija među komercijalnim serijama boja, u Marshallovoj studiji o Azure B, što objašnjava zašto se stepen čistoće reagensa i dalje pojavljuje u raspravama o metodama.

Izbegavanje uobičajenih grešaka

Četiri greške odgovorne su za većinu neuspelih preparata. Naručivanje običnog metilenskog plavog umesto novog metilenskog plavog N daje slabo bojenje zbog hemijskih svojstava, a ne zbog tehnike. Fiksacija ili kontrastno bojenje pre očitavanja uklanja supravitalni signal. Brojanje taloga boje kao granula povećava rezultat, što se sprečava pravilom dve granule i filtriranjem boje. Brojanje premalog broja ćelija pri niskim procentima retikulocita daje broj koji deluje precizno, ali ima široke granice pouzdanosti. Svaka greška ima isti obrazac: mikroskopista krivi mikroskop za ishod koji je određen već u koraku sa reagensom.