Metilensko plavo i neurotransmiteri: serotonin, dopamin, GABA i acetilholin

Često se za metilensko plavo kaže da povećava serotonin, povećava dopamin, umiruje GABA i izoštrava acetilholin, sve istovremeno. Takva rečenica predstavlja četiri odvojena laboratorijska nalaza kao jedan efekat u čoveku. Radovi na kojima se zasniva merili su različite mete, u različitim preparatima, pri koncentracijama koje se razlikuju približno hiljadu puta. Kada razdvojite te mete, slika postaje i zanimljivija i opreznija nego što ta jedna rečenica dopušta.

Osnovna ideja je jednostavna. Molekul koji se veže za enzim u epruveti uradio je jednu stvar: vezao se za enzim u epruveti. Da li to menja nivo neurotransmitera u živom mozgu zavisi od koncentracije koja dospeva do tkiva, od hemijskog oblika u kojem molekul stiže i od svega ostalog što taj molekul radi pri istoj koncentraciji. U svakom odeljku u nastavku ta tri pitanja ostaju vezana za nalaz na koji se odnose.

Serotonin: dve mete, dve koncentracije

Od ova četiri sistema, za serotonin postoje najjači dokazi, a potiču od dve različite molekularne mete koje ne treba spajati.

Prva meta je monoamin-oksidaza tipa A, mitohondrijski enzim koji razgrađuje serotonin. Metilensko plavo inhibira prečišćenu ljudsku MAO-A kao inhibitor sa čvrstim vezivanjem, uz Ki od oko 27 nanomola, dok su za uticaj na MAO-B potrebne mnogo više koncentracije, kao što je pokazano u kinetičkoj studiji koja je povezala ovu boju sa serotoninskom toksičnošću. Povezana istraživanja utvrdila su istu selektivnost u tkivu epifize pacova, gde je blokada MAO-A povećala količinu indola nastalih iz serotonina, smanjila količinu serotoninskog metabolita 5-HIAA i izmenila refleks uspravljanja povezan sa serotoninom kod žaba, kako je navedeno u studiji redoks boja i indola u epifizi. Dva različita preparata, isti smer: manje razgradnje, više zadržanog serotonina tamo gde bi ga enzim inače uklonio.

Druga meta je sam transporter serotonina. U ćelijama koje eksprimiraju ljudski transporter, metilensko plavo smanjilo je preuzimanje i fluorescentnog supstrata i obeleženog serotonina, uz IC50 od oko 1.4 mikromola, a potisnulo je i struje izazvane serotoninom u patch-clamp snimanjima, prema direktnoj karakterizaciji delovanja metilenskog plavog na SERT. Autori su proverili očigledna alternativna objašnjenja i utvrdili da efekat ne zavisi od signalizacije putem cGMP, promena kalcijuma ni ekspresije transportera na površini ćelije.

Obratite pažnju na razliku između ta dva broja. Inhibicija MAO-A odvija se u nanomolarnom opsegu. Za inhibiciju transportera potrebno je približno pedeset puta više boje. Niska izloženost koja u potpunosti deluje na enzim može jedva uticati na transporter. Svako ko ovo spaja u jednu tvrdnju o serotoninu svodi dva različita raspona doza na jedan.

Da li je bilo koja od ove dve mete značajna kod osobe koja uzima druge serotonergičke lekove pitanje je primene lekova i pripada vodiču za interakcije lekova. Ovaj članak mapira mete; ta stranica daje kliničke savete.

Dopamin: najslabiji direktni dokazi

Kod dopamina, pošten pristup zahteva najviše uzdržanosti. Ne postoji dobro potvrđena studija koja pokazuje da metilensko plavo blokira transporter dopamina ili da se direktno vezuje za dopaminske receptore. Često citirana vrednost IC50 za transporter od 1.4 mikromola odnosi se na transporter serotonina, ne na DAT, i nikada je ne treba pripisivati drugom transporteru.

Ono što postoji jeste posredno. Pošto enzimi MAO metabolišu i dopamin, inhibicija MAO čuva dopamin zajedno sa serotoninom i noradrenalinom. U mitohondrijskim preparatima, metilensko plavo blokiralo je pretvaranje neurotoksina MPTP u njegov dopaminergički toksin posredstvom MAO-B, sa potentnošću uporedivom sa deprenilom, lekom za Parkinsonovu bolest, kako opisuju studija bioaktivacije MPTP i povezani radovi o MAO-B. Istraživanja na životinjama dodaju delimične nalaze: približno trostruko povećanje bazalnog oslobađanja dopamina iz preseka strijatuma pacova pri 10 mikromola, ispitivano u kontekstu signalizacije azot-monoksidom, a ne blokade transportera, kao i neujednačene rezultate po regijama nakon sistemske primene, pri čemu su neke studije utvrdile porast serotonina i noradrenalina dok se dopamin jedva menjao.

Dakle, nalazi o dopaminu jesu stvarni, ali posredni. Delovanje ide preko enzima koji istovremeno obrađuje nekoliko monoamina, a ne preko mete specifične za dopamin. Svaka tvrdnja da metilensko plavo povećava dopamin kod ljudi preskače korak u kojem bi to zaista bilo pokazano.

GABA: blokiranje kočnice u džepu za vezivanje

Nalaz za GABA je precizan i suprotan uobičajenoj predstavi o ovoj boji. U ćelijama koje eksprimiraju ljudske GABA-A receptore, metilensko plavo inhibiralo je struje izazvane GABA počevši od oko 3 mikromola, uz IC50 od oko 31 mikromola za čestu konfiguraciju alpha1-beta2-gamma2, u elektrofiziološkoj studiji koja je mapirala mesto delovanja.

Mapiranje mesta delovanja je vredan deo ovog nalaza. Mutacije na mestu vezivanja pikrotoksina nisu promenile inhibiciju, a mesta vezivanja benzodiazepina i cinka isključena su poređenjem podjedinica. Nasuprot tome, mutacije na dva aminokiselinska ostatka za koje je poznato da formiraju sam džep za vezivanje GABA naglo su smanjile blokadu, što ukazuje na kompetitivni antagonizam na mestu vezivanja agonista, a ne na alosternu modulaciju na drugom mestu. Efekat se održao kod kombinacija sinaptičkih i ekstrasinaptičkih podjedinica i brzo je nestajao nakon ispiranja.

To stvara stvarnu protivrečnost koju vredi jasno istaći. Molekul koji se istražuje radi podrške pamćenju istovremeno potiskuje brzi inhibitorni prenos u laboratorijskoj posudi. Da li se to potiskivanje dešava u živom mozgu zavisi od lokalne koncentracije, a 31 mikromol je visoko u odnosu na većinu sistemskih izloženosti, o čemu govori završni odeljak. Sama protivrečnost je nalaz; za njeno razrešenje bili bi potrebni eksperimenti koje niko nije sproveo.

Acetilholin: dve suprotne tačke delovanja

Za acetilholin postoje dva nalaza koja deluju u suprotnim smerovima, što je upravo razlog da se prikažu odvojeno.

S jedne strane, metilensko plavo inhibira enzime koji uklanjaju acetilholin. Acetilholinesteraza iz eritrocita goveda bila je kompetitivno inhibirana pri oko 0.57 mikromola, goveđi enzim pri oko 0.42 mikromola, a aktivnost esteraze u ljudskoj plazmi pri oko 1.1 mikromola, dok je butirilholinesteraza bila inhibirana u rasponu od približno 0.4 do 5.3 mikromola, zavisno od vrste i preparata, kako je sažeto u pregledu delovanja metilenskog plavog u nervnom sistemu. Sporije uklanjanje ostavlja više neurotransmitera u sinapsi, što je ista logika na kojoj se zasniva nekoliko odobrenih lekova za Alchajmerovu bolest.

Ali ta hemija ima uslov. Oksidovani plavi oblik inhibira enzim; redukovani bezbojni oblik ne inhibira ga, a duge inkubacije koje omogućavaju redukciju boje daju slabiju inhibiciju samo iz tog razloga. Svaka vrednost iz ispitivanja holinesteraze nosi skrivenu promenljivu: koliko je boje još bilo plavo u trenutku merenja.

S druge strane, metilensko plavo blokira alpha7 nikotinski receptor, jedan od receptora na koje deluje acetilholin. Ljudski alpha7 receptori eksprimirani u oocitima žaba bili su inhibirani uz IC50 od oko 3.4 mikromola, putem nekompetitivnog antagonizma nezavisnog od napona koji nije menjao potentnost agonista, a 3 mikromola potpuno je ukinulo sinaptičke odgovore izazvane holinom u presecima hipokampusa pacova, kako navodi studija alpha7 receptora. Dakle, pri sličnim niskim mikromolarnim koncentracijama, boja istovremeno čuva neurotransmiter i slabi odgovor jednog od njegovih receptora. Neto efekat na holinergičku signalizaciju ne može se zaključiti ni iz jednog nalaza pojedinačno. Ta neizvesnost povezana je sa širom literaturom o Alchajmerovoj bolesti i sa srodnom raspravom o istraživanju kognicije i bolesti, ali se ovde ne razrešava.

Poređenje na jednom mestu

Tri reda veličine razdvajaju najosetljiviju metu od najmanje osetljive. Taj raspon sažima članak u jednoj tabeli.

Da li ove koncentracije dospevaju do mozga?

Broj iz epruvete ne znači ništa bez podatka o izloženosti pored njega. Nakon intravenskog bolusa od oko 1.4 mg po kg, prijavljeni su prosečni nivoi u ljudskoj plazmi od oko 5 mikromola, dok je oralna doza od 100 mg proizvela nivoe u punoj krvi od oko 0.08 mikromola u istoj istraživačkoj literaturi. Istraživanja raspodele kod pacova nalaze nivoe u mozgu približno deset do dvadeset puta više od nivoa u cirkulaciji, mada je to ukupna boja u homogenizovanom tkivu, a ne slobodna oksidovana boja u sinapsi, dok vezivanje za proteine plazme od oko 94 posto, zajedno sa raspodelom u krvne ćelije, dodatno smanjuje slobodnu frakciju.

Kada se uporedi sa tabelom, obrazac je postepen, a ne binaran. Inhibicija MAO-A javlja se znatno ispod tipičnih intravenskih izloženosti i farmakološki je verovatna kad god se boja primenjuje tim putem. Efekti na holinesterazu i alpha7 nalaze se u niskom mikromolarnom opsegu koji se preklapa sa vršnim nivoima nakon intravenske primene, ali koji uobičajene oralne doze možda ne dostižu. IC50 za GABA-A od 31 mikromola nalazi se iznad većine verovatnih sistemskih izloženosti, pa je tu konkretnu blokadu najteže pretpostaviti u celom ljudskom organizmu. Svaki red ovog poređenja zahteva istu ogradu: relevantna koncentracija jeste koncentracija slobodne, oksidovane, vanćelijske boje na meti, veličina koju nijedno uzimanje uzorka krvi ne meri direktno.

Šta ne treba zaključiti

Nijedan red u tabeli ne utvrđuje da metilensko plavo predvidljivo povećava ili smanjuje bilo koji neurotransmiter kod čoveka. Inhibicija enzima u prečišćenom preparatu, blokada transportera u ćelijskoj liniji i antagonizam receptora u preseku tkiva predstavljaju po jedan kontrolisani korak udaljen od sinaptičke stvarnosti, a odeljak o acetilholinu pokazuje kako dva tačna nalaza zajedno ostavljaju neizvestan ishod. Odgovorna upotreba ove stranice jeste da služi kao mapa tačaka delovanja za koje je pokazano da ih molekul zahvata, uz označenu jačinu tog delovanja, kako bi rasprava o mehanizmima ostala utemeljena u onome što je zaista izmereno. Za to kako ove tačke delovanja utiču na interakcije sa propisanim lekovima, vodič za interakcije jeste stranica koja obrađuje tu temu, uz dodatni kontekst u osnovama farmakologije i pratećem objašnjenju mehanizama.