Metilensko plavo i masna jetra: šta su pokazala eksperimentalna istraživanja

Masna jetra je jedan naziv za nekoliko različitih problema. Kod jedne osobe okidač je dugotrajna prekomerna upotreba alkohola. Kod druge je to prekomeran unos hranljivih materija uz insulinsku rezistenciju i pojačan dotok masti u jetru. Pod mikroskopom se u oba slučaja može videti jednostavno nakupljanje masti, ali se početni uzroci razlikuju. Ta razlika određuje šta bilo koji eksperiment može da dokaže.

Literatura o metilenskom plavom i masnoj jetri je oskudna i u vezi s ovim pitanjem u potpunosti pretklinička. Najčešće se citiraju tri istraživanja na pacovima i miševima, a njihovi nalazi ne ukazuju svi na isto. Jedno istraživanje sa etanolom u ishrani korigovalo je redoks promenu, ali je količina masti u jetri ostala nepromenjena. Jedno istraživanje sa ishranom bogatom mastima pokazalo je smanjenje masti u jetri uz promenu signalizacije. Jedno istraživanje na zdravim životinjama pokazalo je suprotne rezultate lipidne peroksidacije u jetri i bubregu. Posmatrana zajedno, ona pokazuju zašto tri ishoda moraju ostati odvojena: redoks promena, aktivacija signalizacije i nakupljanje masti u tkivu.

Tri ishoda koja je lako pomešati

Redoks pokazatelj opisuje procese prenosa elektrona. Odnos NAD+ prema NADH u jetri pokazuje da li je ćelijsko okruženje relativno oksidovano ili redukovano. Oksidacija etanola pretvara NAD+ u NADH, pa dugotrajno konzumiranje alkohola snižava taj odnos. Boja koja prihvata elektrone može ponovo da ga poveća. To je hemija, a ne dokaz da ima manje uskladištene masti.

Pokazatelj signalizacije opisuje regulaciju. SIRT1 je regulatorni enzim zavisan od NAD+ koji modifikuje proteine uključene u funkciju mitohondrija i metabolizam lipida. AMPK deluje kao senzor niskog energetskog statusa koji, kada se aktivira, podstiče oksidaciju energetskih supstrata i ograničava sintezu lipida. Kada rad navodi da metilensko plavo aktivira SIRT1 u jetri, on izveštava o promeni regulacije. To još nije izveštaj o ishodu kod pacijenta.

Histološki ili biohemijski pokazatelj opisuje samu jetru. Uobičajeni primeri su sadržaj triglicerida po gramu tkiva, bojenje neutralnih masti bojom Oil Red O, procena baloniranja ćelija i oštećenja bojenjem hematoksilinom i eozinom, kao i aktivnost ALT u plazmi. Samo ova treća grupa pokazatelja odgovara na pitanje da li je metilensko plavo u tom eksperimentu ublažilo steatozu jetre.

Razdvajanje ovih grupa sprečava najčešće pogrešno tumačenje: povoljan redoks rezultat ili rezultat signalizacije ne znači manje masne jetre.

Etanolski model: redoks stanje korigovano, mast nepromenjena

Najjasniji negativan nalaz potiče iz istraživanja dugotrajne ishrane sa etanolom kod mužjaka Wistar pacova. Životinje su dobijale etanol kao deo tečne ishrane, sa udelom koji je rastao do 36 procenata ukupne energije, dok su kontrolne životinje hranjene ekvivalentnom količinom hrane dobijale glukozu umesto energije iz etanola. Jedna grupa koja je dobijala etanol i jedna kontrolna grupa dobijale su i metilensko plavo u koncentraciji od 130 mg po litru tečne hrane, oko 42 mg po kg dnevno, od dana 5 do dana 30.

Redoks stanje procenjeno je pomoću standardnih parova metabolita: odnosa laktata prema piruvatu za citosol i odnosa 3-hidroksibutirata prema acetoacetatu za mitohondrije. U ranoj fazi ishrane sa visokom dozom etanola, grupe koje su dobijale etanol pokazale su velike promene: odnos NAD+ prema NADH u citosolu smanjen je za oko 62 procenta, a u mitohondrijama za oko 71 procenat, uz viši nivo glicerol 3-fosfata. Metilensko plavo je u velikoj meri preokrenulo te promene i vratilo glicerol 3-fosfat blizu kontrolnih vrednosti, bez promene unosa etanola, porasta telesne mase ili nivoa etanola u serumu.

Mast u jetri pokazala je drugačiju sliku. Na dan 12, pre značajnog nakupljanja masti, nivo triglicerida nije se razlikovao među grupama. Na dan 27, grupe koje su dobijale etanol imale su velika povećanja triglicerida bez obzira na metilensko plavo. Na dan 30, ukupni lipidi porasli su za oko 89 procenata, a trigliceridi za oko 196 procenata kod životinja hranjenih etanolom, ponovo bez uticaja boje. Centrilobularna masna infiltracija izgledala je isto sa tretmanom ili bez njega. Autori su zaključili da redoks promena izazvana etanolom nije primarni uzrok masne jetre nakon dugotrajne ishrane u ovom modelu. Ovde pomaže razumevanje toga kako se nalazi na životinjama i ćelijama prenose na procenu rizika kod ljudi: mehanizam može biti stvaran, a da ipak ne određuje ishod.

Ovo je istraživanje koje treba citirati kada neko tvrdi da svaka korekcija redoks stanja mora da ukloni mast iz jetre. U ovom eksperimentalnom dizajnu to se nije dogodilo.

Metabolički model: signalizacija uz manje masti, kod miševa

Drugačija slika dolazi iz istraživanja na hepatocitima i miševima na ishrani bogatoj mastima, usmerenog na SIRT1 i AMPK. U ćelijama HepG2, ćelijama AML-12 i primarnim hepatocitima pacova, metilensko plavo povećalo je odnos NAD+ prema NADH, povećalo nivo proteina SIRT1, smanjilo acetilaciju regulatora PGC-1alpha, povećalo sadržaj mitohondrijske DNK i potrošnju kiseonika i aktiviralo AMPK, uz posledična povećanja CPT-1 i PPARalpha. Kada je ekspresija SIRT1 smanjena, aktivacija AMPK je izostala, što povezuje ovaj sled sa SIRT1 u tom ćelijskom sistemu. Boja je takođe suzbijala lipogene signale izazvane agonistom LXR T0901317 i izlaganjem palmitatu, uključujući indukciju SREBP-1c, FAS i ACC.

U životinjskom delu istraživanja korišćeni su mužjaci miševa C57BL/6 koji su tokom 8 nedelja dobijali ishranu sa 60 procenata masti, uz oralnu primenu metilenskog plavog četiri puta nedeljno tokom poslednje 4 nedelje, u dozi od 3 ili 10 mg po kg dnevno. Tretirani miševi pokazali su manje bojenja bojom Oil Red O, niži nivo triglicerida u jetri, manje baloniranja ćelija i masne degeneracije na histološkom pregledu i niži ALT u plazmi nego netretirani miševi na ishrani bogatoj mastima. Farmakokinetičko ispitivanje u istom radu utvrdilo je oralnu bioraspoloživost od približno 31 do 35 procenata, uz gotovo potpunu apsorpciju iz creva, ali i značajan metabolizam, kao i najveći odnos koncentracije u tkivu prema koncentraciji u plazmi u jetri. To čini efekat na jetru barem mogućim sa stanovišta distribucije.

To je stvaran signal smanjenja steatoze, ali su granice tog nalaza uske. Reč je o kratkom eksperimentu na miševima, sa 9 do 10 životinja po grupi, jednom vrstom ishrane, dve doze i četiri nedelje tretmana. On ispituje metaboličku steatozu i karakteristike steatohepatitisa, a ne bolest povezanu sa alkoholom, i ne ispituje cirozu, povlačenje fibroze niti bilo koji ishod kod ljudi. Uloga mitohondrijskih i redoks pokazatelja u tumačenju takvih rezultata jeste da ih označe kao podršku hipotezi, a ne kao osnovu za dozu ili protokol.

Presek stanja zdravih tkiva: ista doza, suprotni efekti u organima

Treće istraživanje često se uključuje u tvrdnje o jetri kojima ne pripada. U eksperimentu u trajanju od 30 dana na zdravim ženkama Wistar pacova, pet životinja dobijalo je 1 mM metilenskog plavog u vodi za piće, a pet je služilo kao kontrola. Superoksid dismutaza, katalaza i redukovani glutation nisu se promenili ni u jetri ni u bubregu. Lipidna peroksidacija blago je porasla u jetri, a opala u bubregu. ALT i kreatinin u serumu su opali, bez promene azota uree u krvi.

Ispravno tumačenje jeste specifičnost odgovora tkiva kod zdravih životinja, a ne lečenje bolesti. Ista izloženost je prema jednom pokazatelju delovala blago prooksidativno u jetri, a prema istom pokazatelju blago zaštitno u bubregu, dok su standardni antioksidativni odbrambeni mehanizmi ostali nepromenjeni. Sa pet životinja po grupi i bez modela bolesti, ovaj rad upozorava da metilensko plavo ne treba nazivati opštim antioksidansom za jetru. Takođe pokazuje zašto promene jetrenih enzima zahtevaju jasno definisan kontekst bolesti pre nego što se mogu tumačiti kao poboljšanje.

Poređenje tri eksperimenta na jetri

Tabela jasno pokazuje glavnu poruku. Slična plava boja, različita biologija. Istraživanje sa etanolom razdvaja uspešnu korekciju redoks stanja od neuspeha u smanjenju masti. Istraživanje ishrane povezuje signalizaciju i smanjenje masti u jednom modelu. Istraživanje na zdravim životinjama pokazuje da redoks markeri mogu da se menjaju u suprotnim smerovima u različitim organima.

Zašto iz ovoga ne sledi tvrdnja o lečenju

Nijedno od ovih istraživanja nije uključivalo ljude sa masnom jetrom. Doze, putevi primene i trajanje razlikuju se među radovima i ne mogu se jednostavnim preračunavanjem pretvoriti u režim primene kod ljudi. Male grupe, naročito tri životinje po vremenskoj tački merenja redoks stanja u istraživanju sa etanolom i pet po grupi u istraživanju na zdravim životinjama, ostavljaju znatnu neizvesnost. Pol, soj, sastav ishrane i vreme početka tretmana u odnosu na nastanak oštećenja razlikuju se. A dva modela bolesti predstavljaju različite početne uzroke, pa pozitivan rezultat ishrane ne može da poništi negativan rezultat etanola, niti obrnuto.

Za svakoga sa dijagnostikovanom bolešću jetre, važnije je tumačenje usmereno na mere opreza nego na lečenje. Pregled mera opreza za bubrege i jetru pri upotrebi metilenskog plavog objašnjava zašto oštećenje funkcije organa menja pitanja bezbednosti čak i kada rad na životinjama deluje povoljno. Ponesite lekaru dijagnozu, novije laboratorijske nalaze, podatke o tačnom proizvodu i putu primene i potpun spisak lekova, pa pitajte koji dokazi podržavaju taj proizvod za tu namenu kod osobe sa tim stepenom oštećenja funkcije.

Zaključak: metilensko plavo promenilo je redoks stanje jetre u jednom etanolskom modelu bez smanjenja uskladištene masti, aktiviralo SIRT1 i AMPK uz smanjenje masti u jednom metaboličkom modelu na miševima i pokazalo redoks efekte specifične za pojedine organe kod zdravih pacova. To je skup smernica za istraživanje, a ne utvrđena terapija za masnu jetru.