Zašto se metilensko plavo koristi kao kontrastna boja u acidorezistentnom bojenju

Tehničar pregleda razmaz sputuma nakon celokupnog postupka bojenja. Crveni štapići se ističu na plavom polju, a u izveštaju se navodi da su uočeni acidorezistentni bacili. Sledećeg dana na drugom preparatu vidi se ravnomerno plavo polje bez crvenih štapića, pa se nalaz prijavljuje kao negativan na tuberkulozu. Jedan od ovih izveštaja tvrdi više nego što preparat može da potkrepi — i to nije prvi.

Zabuna je konceptualne prirode. Tehničar je plavu boju posmatrao kao deo hemije detekcije, kao da metilensko plavo pomaže u pronalaženju mikobakterija. To nije slučaj. Dok metilensko plavo dospe na preparat, test je već završen. Boja samo boji pozadinu kako bi rezultat bio čitljiv. Ovaj članak objašnjava svrhu metilenskog plavog u acidorezistentnom bojenju, zašto se koristi baš plava, a ne neka druga boja, i kakve zaključke dopušta crveno na plavoj pozadini.

Kratak odgovor

Acidorezistentno bojenje je diferencijalni test zasnovan na tri principa. Karbol-fuksin, primarna boja, prinudno prodire u svaku ćeliju, uključujući mikobakterije sa voštanim omotačem. Kiseli alkohol, sredstvo za obezbojavanje, uklanja crvenu boju iz običnih ćelija, ali ne uspeva da je izvuče iz acidorezistentnih. Metilensko plavo, kontrastna boja, zatim boji sve iz čega je sredstvo za obezbojavanje uklonilo boju, pa neacidorezistentne ćelije, ćelije domaćina i ostaci izgledaju plavo, dok acidorezistentni bacili ostaju crveni. Kontrastna boja obezbeđuje kontrast. Ne učestvuje u hemijskim procesima koji ćeliju čine acidorezistentnom.

Uloga svakog koraka

Dijagram ispod prikazuje podelu uloga. Čitajte ga sleva nadesno kao postupak, a donju traku kao podsetnik da svaka grupa metoda bojenja odgovara na drugačije pitanje.

Prodiranje je prvi korak. Mikobakterije odolevaju običnim vodenim bojama jer je njihov omotač izrazito hidrofoban, pa protokol omogućava prinudno prodiranje. U Ziehl-Neelsenovoj metodi zagrevanje do pojave pare omogućava karbol-fuksinu koji sadrži fenol da prodre kroz voštani zid. U Kinyounovoj hladnoj metodi zagrevanje se zamenjuje znatno jačom formulacijom primarne boje, a neke modifikovane verzije bez zagrevanja dodaju površinski aktivne supstance. Protokoli Američkog društva za mikrobiologiju za acidorezistentno bojenje prikazuju obe formulacije uporedo, a razlika u koncentraciji je izrazita: približno 0.3 g baznog fuksina na 100 mL za metodu sa zagrevanjem naspram oko 4 g za hladnu metodu.

Diferencijacija je drugi korak. Kiseli alkohol, obično 3 mL koncentrovane hlorovodonične kiseline u 97 mL etanola od 95 procenata, ispira crvenu boju iz svake ćelije čiji zid ne pruža poseban otpor. Ćelije sa očuvanim mikobakterijskim lipidnim omotačem zadržavaju boju. To je ključni korak cele metode i korak koji je najosetljiviji na način izvođenja, kao što je objašnjeno u nastavku.

Kontrast dolazi na kraju. Na preparatu su sada crvene acidorezistentne ćelije na gotovo bezbojnoj pozadini ćelija iz kojih je boja uklonjena. Metilensko plavo u koncentraciji od 0.3 procenta w/v ponovo čini tu pozadinu vidljivom, u boji koja se maksimalno razlikuje od crvene. Kontrastno bojenje je kratko, obično 20 do 30 sekundi u metodi sa zagrevanjem i do nekoliko minuta u nekim varijantama hladne metode; trajanje zavisi od protokola, a ne od svojstava same boje.

Zašto ova boja i zašto plava

Metilensko plavo je katjonska bazna boja, što znači da njen obojeni jon nosi pozitivno naelektrisanje i vezuje se za negativno naelektrisane površine obezbojenih bakterija, ćelija domaćina i ostataka. OpenStax mikrobiologija opisuje ovu ulogu naelektrisanja kao opšti princip delovanja baznih boja. Međutim, metilensko plavo ovde nije hemijski jedinstveno. Kristal-violet i safranin takođe su bazne boje. Izbor je optički, a ne hemijski.

Crvenim štapićima potrebna je pozadina kontrastne nijanse, a plava pruža najkorisniji kontrast u odnosu na crvenu za mikroskopiju svetlog polja. Safranin bi bio loša kontrastna boja jer je njegova završna ružičastocrvena nijansa previše bliska zadržanom karbol-fuksinu, čime se gubi upravo ona razlika koju je postupak stvorio. Kristal-violet bi dao tamnoljubičastu pozadinu koja se sa tankim crvenim bacilima nadmeće za pažnju. Najjači dokaz da je uloga kontrast, a ne hemija, jeste mogućnost zamene: zelene kontrastne boje poput malahitnog zelenog i briljantnog zelenog koriste se u nekim veterinarskim i modifikovanim protokolima, a test i dalje funkcioniše, jer svaka jasno različita nijansa obavlja isti posao.

Iz toga slede dve praktične posledice. Prvo, standardna receptura ne predviđa podešavanje pH; nemojte mešati ovaj običan vodeni rastvor od 0.3 procenta sa alkalnim formulacijama poput Loefflerovog metilenskog plavog, koje pripadaju drugačijem konceptu bojenja. Drugo, preterivanje šteti. Histološka literatura izričito upozorava da previše intenzivna plava pozadina može prikriti malobrojne bacile, pa držanje preparata pod bojom duže nego što protokol dopušta smanjuje čitljivost bez ikakve koristi.

Hemija ćelijskog zida koja omogućava test

Razlog za selektivno delovanje kiselog alkohola leži u mikobakterijskom omotaču. Njegovo strukturno jezgro je kompleks mikolil-arabinogalaktan-peptidoglikan: peptidoglikan povezan sa arabinogalaktanom, na čijim se spoljašnjim krajevima nalaze mikolne kiseline veoma dugih lanaca, koje formiraju spoljašnju mikomembranu bogatu lipidima i izrazito niske propustljivosti. Pregled spoljašnje membrane mikobakterija detaljno opisuje ovu strukturu. Barijera deluje u oba smera. Odupire se ulasku boje, zbog čega su za prodiranje potrebni zagrevanje ili jača primarna boja, a odupire se i izvlačenju boje, zbog čega kiseli alkohol ne uspeva da ukloni karbol-fuksin kada se on već nađe unutra. Obične bakterije nemaju ovaj omotač i gube boju. Acidorezistentnost je zato najbolje razumeti kao pojavu povezanu sa lipidnom barijerom, a ne kao hemijsko vezivanje fuksina za mikolnu kiselinu.

Ova hemija objašnjava i čestu nedoumicu: mikobakterije se Gramovom metodom boje slabo i nepredvidivo, ponekad izgledajući kao bledi zrnasti oblici ili neobojene senke. Njihov hidrofobni zid ograničava prodiranje kristal-violeta. Acidorezistentno bojenje nije modifikovano Gramovo bojenje. To je drugačiji princip diferencijacije zasnovan na drugom svojstvu zida, kao što poređenje jednostavnog i Gramovog bojenja pokazuje za te druge dve metode.

Tri metode, tri pitanja

Za širu grupu metoda bojenja bakterija jednom bojom pogledajte atlas bojenja za mikroskopiju.

Šta crveno na plavoj pozadini ne može da dokaže

Crveni štapići znače da su organizmi zadržali karbol-fuksin tokom izlaganja kiselom alkoholu. Taj nalaz je u skladu sa prisustvom Mycobacterium tuberculosis, ali smernice CDC-a za dijagnostiku tuberkuloze izričito navode da su i druge mikobakterije acidorezistentne, pa su za identifikaciju vrste potrebni kultivacija i testiranje nukleinskih kiselina, a ne boja.

Greške u izvođenju najčešće su povezane sa dva koraka ispiranja. Nedovoljno obezbojavanje ostavlja materijal u pozadini crvenim i pogoduje lažno pozitivnom očitavanju. Prekomerno obezbojavanje uklanja slabije zadržanu primarnu boju i doprinosi lažno negativnim rezultatima. Preintenzivno kontrastno bojenje skriva malobrojne bacile u plavilu. Debeli razmazi, istaloženi reagensi i kontaminirana voda za ispiranje stvaraju dodatne artefakte.

Osetljivost je ograničena količinom prisutnih organizama, bez obzira na to koliko je tehnika besprekorno izvedena. Za konvencionalnu mikroskopiju razmaza potrebno je približno 5,000 do 10,000 bacila po mililitru sputuma, a stariji pregledi dokaza CDC-a procenili su osetljivost razmaza na oko 45 do 80 procenata među plućnim slučajevima potvrđenim kultivacijom. Negativan razmaz zato nikada ne isključuje tuberkulozu. Važeće smernice CDC-a predviđaju kultivaciju uz svaki razmaz i preporučuju testiranje amplifikacijom nukleinskih kiselina na najmanje jednom respiratornom uzorku kada se razmatra plućna tuberkuloza i kada bi rezultat promenio dalje postupanje.

Praktičan rad mora da se zasniva na odobrenim protokolima

Edukativni opisi, uključujući ovaj članak, nisu ovlašćenje za klinički rad. Za praktičan laboratorijski rad sledite validiranu standardnu operativnu proceduru laboratorije, usklađenu sa važećim dokumentima CDC-a, APHL-a ili CLSI-ja; referentni dokument CDC-a o acidorezistentnom bojenju u arhivi Stacks pokazuje kako takve procedure određuju reagense i očitavanje rezultata. Rad sa uzorcima za tuberkulozu zahteva mere biološke zaštite: razmazi se pripremaju u kabinetu za biološku bezbednost jer priprema stvara aerosole i prskanje, a smernice CDC-a za laboratorijsku bezbednost navode da čak i toplotno fiksirani razmazi mogu sadržati žive bacile tuberkuloze i da se njima i dalje mora rukovati kao kontaminiranim materijalom. Unos u CDC-ovoj biblioteci slika javnog zdravlja koji prikazuje razmaz obojen karbol-fuksinom i metilenskim plavim, pregledan na M. leprae koristan je podsetnik da primena metode nije ograničena na tuberkulozu: isti kontrast crvenog na plavom služi svuda gde se traže acidorezistentni organizmi, a pažljivo očitan negativan nalaz i sam je rezultat koji vredi zabeležiti.

Očitavanje gotovog preparata

Kontrastna boja pokazuje svoju vrednost tokom pregledanja preparata. Mikroskopista koji pregleda preparat pri malom uveličanju prvo koristi plavu pozadinu da proceni kvalitet razmaza: ravnomernu raspodelu ćelija, očuvane ćelije domaćina za fokusiranje i odsustvo obilnog taloga. Potencijalni crveni bacili zatim privlače pogled upravo zato što ništa drugo na preparatu nije crveno. Potvrda se obavlja uz uljnu imerziju, pri kojoj pravi bacili pokazuju očekivani izgled tankih, ponekad blago zakrivljenih ili zrnastih štapića, a ne jednoličnih ostataka boje.

Bojenje pozadine određuje i formulaciju izveštaja. Za preparat sa crvenim bacilima navodi se da su uočeni acidorezistentni bacili, često uz semikvantitativnu ocenu prema skali laboratorije. Za preparat bez crvenih organizama navodi se da nisu uočeni acidorezistentni bacili, nikada da je negativan na tuberkulozu. Ta razlika je važna jer plavo polje pokazuje da je bojenje uspelo, da su ćelije primile kontrastnu boju i da su optički uslovi bili odgovarajući, ali ne govori ništa o organizmima ispod granice detekcije. Plavo polje bez uočenih bacila jeste validan rezultat o preparatu, a ne zaključak o pacijentu.

Zapamtite podelu uloga i formulacija izveštaja postaje jasna. Karbol-fuksin otkriva moguće bacile. Kiseli alkohol sprovodi test. Metilensko plavo samo čini odgovor čitljivim: crveno je zadržalo boju uprkos kiselini, plavo ju je izgubilo. Sve ostalo — vrsta, količina organizama i kliničko značenje — utvrđuje se radom koji prevazilazi pregled preparata.