Metilensko plavo i izlaganje svetlosti: talasna dužina, iradijansa i geometrija tretmana

Dva rada navode da je metilensko plavo izloženo svetlosti od 10 J po kvadratnom cm. U jednom se uništavaju bakterije. U drugom nema merljivog efekta. Čitalac koji poredi samo dozu zaključuje da je ova oblast nedosledna. Oblast je dosledna. Doza nikada nije predstavljala celokupno izlaganje.

Izlaganje svetlosti je mali sistem parametara koji deluju zajedno: talasna dužina, iradijansa, trajanje, rezultujuća fluenca, dostupnost kiseonika, koncentracija i stanje agregacije boje, vremenski razmak između primene boje i svetlosti i optički put kojim svetlost zaista prolazi kroz uzorak. Promenite jedan parametar i fotohemija se menja. Ovaj članak razmatra svaki parametar, a zatim razdvaja fotobiomodulaciju bliskom infracrvenom svetlošću od direktne fotoaktivacije boje, jer se ta dva režima najčešće mešaju.

Talasna dužina određuje da li boja učestvuje

Metilensko plavo u vodi snažno apsorbuje crvenu svetlost kao monomer, sa maksimumom blizu 664 do 665 nm i ramenom apsorpcione trake na kraćoj talasnoj dužini, blizu 610 nm, koje raste kako boja formira dimere i veće agregate naslaganih molekula. Molarni ekstinkcioni koeficijent blizu maksimuma je reda veličine 65,000 do 85,000 M-1 cm-1, pa su već i mikromolarni rastvori intenzivno plavi. Rani pregled fotohemije metilenskog plavog sa DNK i biološkim supstratima opisuje ovo apsorpciono ponašanje i hemiju pobuđenog stanja koja sledi: apsorpcija dovodi molekule u kratkoživeće singletno stanje, iz kojeg prelaze u dugovečnije tripletno stanje sa prijavljenim prinosima blizu 0.5, koje kiseonik u aerisanom rastvoru gasi za oko 2 mikrosekunde.

U tom koraku gašenja razdvajaju se dva fotohemijska puta. U hemiji tipa II boja u tripletnom stanju prenosi energiju na kiseonik u osnovnom stanju i stvara singletni kiseonik, sa često navođenim prinosima blizu 0.52. U hemiji tipa I triplet umesto toga prenosi elektron ili vodonik na supstrat, stvarajući radikale, uključujući superoksidne i hidroksilne vrste. Oba puta mogu se odvijati istovremeno, a konvencionalni fotodinamički efekat ostaje snažno zavisan od kiseonika čak i kada doprinosi tip I.

Iz toga sledi jednostavno pravilo za izbor talasne dužine za metilensko plavo. Crvena svetlost od oko 630 do 680 nm preklapa se sa apsorpcionom trakom boje, pri čemu je 660 do 665 nm blizu maksimuma monomera, pa može pokrenuti fotohemijske reakcije posredovane fotosenzibilizatorom svuda gde je prisutna značajna količina boje. Bliska infracrvena svetlost na 810 nm nalazi se daleko izvan apsorpcione trake osnovnog stanja, pa je to nepogodna talasna dužina za direktno pobuđivanje boje. Koncentracija komplikuje sliku na jedan stvaran način: kako koncentracija raste, veći deo boje nalazi se u dimernim i agregiranim oblicima koji apsorbuju bliže 610 nm i manje efikasno fotosenzibilišu po molekulu, pa udvostručavanje količine boje ne udvostručuje efekat. Prateći pregled metilenskog plavog i terapije crvenom svetlošću tretira ovo pravilo apsorpcije kao preduslov za svaku fotosenzibilisanu reakciju.

Iradijansa, trajanje i fluenca su tri parametra, a ne jedan

Fluenca, izražena u J po kvadratnom cm, jeste iradijansa pomnožena vremenom. Navođenje samo fluence prikriva brzinu kojom je energija pristizala, a ta brzina je važna.

Visoka iradijansa tokom kratkog izlaganja i niska iradijansa tokom dugog izlaganja mogu dati istu fluencu uz različitu hemiju. Visoka iradijansa troši rastvoreni kiseonik brže nego što ga difuzija nadoknađuje, što tokom izlaganja ograničava put tipa II zavisan od kiseonika. Ona takođe unosi toplotu, a tkivo na zagrevanje reaguje promenama protoka krvi koje menjaju i oksigenaciju i raspodelu boje. Niska iradijansa tokom dugog izlaganja održava snabdevanje kiseonikom, ali procesima oporavka i ponovne oksigenacije daje vreme da deluju tokom samog izlaganja. Udžbenici fotohemije pretpostavku da je važna samo ukupna doza nazivaju reciprocitetom. Ona ne važi kad god učestvuju kiseonik, zagrevanje ili biološki procesi, što je u tkivu gotovo uvek slučaj.

Antimikrobna fotodinamička izlaganja metilenskim plavim kod ljudi obično koriste 6 do 18 J po kvadratnom cm, što se preklapa sa vrednostima za fotobiomodulaciju. Zato sama fluenca ne može identifikovati režim. Izlaganje od 10 J po kvadratnom cm na 660 nm u tkivu koje sadrži boju jeste fotohemija posredovana fotosenzibilizatorom. Ista fluenca na 810 nm u tkivu sa boјom u tragovima predstavlja nešto sasvim drugo. Broj se poklapa. Koncept se razlikuje.

Optički put i geometrija uzorka određuju na šta svetlost nailazi

Prema Beer–Lambertovom zakonu, prednji deo uzorka prima daleko više svetlosti od zadnjeg. U kiveti sa bojom u koncentraciji od više desetina mikromola, prvi milimetar može apsorbovati većinu upadne crvene svetlosti, ostavljajući dublje slojeve praktično neizloženim. Ako se isti rastvor smesti u plitko udubljenje u maloj zapremini, izlaganje postaje gotovo ravnomerno. Ista boja, ista lampa, ista fluenca na površini, drugačiji rezultat.

Tkivo, pored apsorpcije, doprinosi i rasejanjem. Crvena svetlost blizu 660 nm prodire do dubine reda veličine milimetara, a tačna dubina zavisi od sadržaja krvi, pigmentacije i vrste tkiva. Udubljenja na pločama unose sopstvene artefakte: efekat sočiva usled meniskusa, refleksiju od zidova, zasenčenje rubnih udubljenja i zagrevanje malih zapremina ispod izvora. Dve laboratorije koje navode identična podešavanja lampe, ali različite vrste ploča, zapremine ili udaljenosti izvora, sprovele su različite eksperimente.

Udaljenost zaslužuje poseban naglasak jer je najčešća prećutana promenljiva. Iradijansa brzo opada sa udaljenošću od nekolimiranog izvora, pa pomeranje lampe sa 2 cm na 5 cm iznad ploče može nekoliko puta smanjiti iradijansu, dok opis u odeljku o metodama ostaje isti. Bez izmerene iradijanse na površini uzorka, objavljene fluence izračunate na osnovu snage koju navodi proizvođač predstavljaju procene, a ne merenja.

Vodič kroz parametre sa napomenama: šta čini izlaganje ponovljivim

Originalni prilog za ovu stranicu je kontrolna lista. Nijedno izlaganje svetlosti u studiji koje izostavlja ove stavke ne može se porediti sa drugim, ma koliko slično izgledala istaknuta doza.

1. Talasna dužina i širina spektralne trake. Maksimum i puna širina, a ne naziv boje. Crvene LED diode pokrivaju opseg od 630 do 680 nm, u kojem se apsorpcija boje veoma razlikuje.
2. Iradijansa na površini uzorka, izmerena, u mW po kvadratnom cm. Snaga koju navodi proizvođač nije iradijansa.
3. Trajanje i pulsiranje. Kontinuirano naspram pulsnog izlaganja, uključujući frekvenciju impulsa i radni ciklus gde je primenljivo.
4. Fluenca izračunata iz prethodno navedenog izmerenog para, u J po kvadratnom cm.
5. Koncentracija, formulacija i stanje agregacije boje. Monomer blizu 664 nm fotosenzibiliše drugačije od agregata blizu 610 nm.
6. Interval između primene preparata i svetlosti. Minuti do sati između primene boje i ozračivanja, što određuje gde se boja nalazi kada svetlost stigne.
7. Oksigenacija. Aerisani rastvor naspram hipoksičnog tkiva direktno menja ravnotežu između tipa I i tipa II.
8. Geometrija. Dubina uzorka, zapremina, vrsta posude, udaljenost i ugao izvora i dubina ciljnog mesta u tkivu.

Korisna navika pri čitanju radova: prvo proverite interval između primene preparata i svetlosti. On otkriva nameru. U fotodinamičkim eksperimentima namerno se ozračuje tkivo koje sadrži boju. Kombinovani eksperimenti mogu namerno vremenski razdvojiti ta dva postupka, kao u primerima ispod.

Fotobiomodulacija bliskom infracrvenom svetlošću nije fotoaktivacija boje

Fotobiomodulacija, obično skraćeno PBM, koristi crvenu ili blisku infracrvenu svetlost za modulaciju endogene signalizacije bez dodavanja fotosenzibilizatora. Fotodinamička terapija, obično skraćeno PDT, koristi tri komponente zajedno: svetlost koju senzibilizator apsorbuje, sam senzibilizator i kiseonik, kako bi stvorila nagli porast reaktivnih vrsta koje oštećuju cilj. Pregled mitohondrija kao cilja neuroprotekcije povezuje metilensko plavo sa PBM jer iz različitih pravaca deluju na ćelijsko disanje: boja deluje kao katalizator u redoks ciklusu koji podržava tok elektrona, dok se za PBM pretpostavlja da podstiče disocijaciju inhibitornog azot-monoksida sa citohrom c oksidaze u kompleksu IV. Taj enzimski mehanizam treba i dalje označavati kao hipotezu.

Dve najčešće citirane kombinovane studije na miševima koriste svetlost od 810 nm, što je upravo razlog zašto ne pokazuju fotoaktivaciju boje. U studiji predtretmana pre uskraćivanja sna, miševi su pre uskraćivanja sna dobijali svakodnevno metilensko plavo u količini od 0.5 mg po kg, pulsni laser od 810 nm svaki drugi dan ili oba. Kombinovani predtretman zaštitio je ponašanja povezana sa pamćenjem i sinaptičke proteine hipokampusa, dok pojedinačni tretmani uglavnom nisu uspeli. U studiji hroničnog stresa sa uporednim tretmanima, miševi su dobijali PBM na 810 nm pri 8 J po kvadratnom cm uz svakodnevnu primenu boje od 0.5 mg po kg, pri čemu je laser primenjivan prvi, a boja ubrizgavana dva sata kasnije, izričito da bi se izbeglo ozračivanje tkiva koje sadrži boju. Sva tri tretmanska kraka poništila su deficite učenja, uz aditivnu korist uglavnom za kortizol u serumu i reaktivne kiseonične vrste u mozgu. Ovi rezultati ispituju dve mitohondrijske intervencije primenjene zajedno, a zbirka fotodinamičkih studija tu razliku čini vidljivom beleženjem talasne dužine za svaku indikaciju.

Dokazi koji se odnose na kožu nalaze se na drugoj strani. Podaci o kombinaciji metilenskog plavog i svetlosti na ljudskoj koži grupišu se u opsegu od 630 do 680 nm, uz lokalnu ili intralezionu primenu boje i cilj destrukcije ili remodelovanja, što je po definiciji PDT. Navoditi takvo uklanjanje promena kao dokaz da boja pojačava PBM, ili navoditi poboljšanje kod miševa na 810 nm kao dokaz da panel od 660 nm uz boju predstavlja protokol za kogniciju, znači mešati ove režime. Referentni vodič za doziranje i farmakologiju i vodič za bezbednost i interakcije dalje razrađuju delove ove teme koji se tiču koncentracije i kontraindikacija.

Definišite koncept pre nego što uporedite brojeve. Talasna dužina određuje da li boja apsorbuje svetlost. Iradijansa i trajanje određuju šta hemijski procesi rade sa tom apsorpcijom. Geometrija određuje koji deo uzorka uopšte doživljava te procese. Dva izlaganja koja se poklapaju u jednom parametru, a razlikuju u ostalima, predstavljaju različite eksperimente, a tretiranje tih izlaganja kao međusobno zamenljivih jeste greška koju ovaj vodič nastoji da spreči. Iz svega ovoga ne proizlazi nikakav protokol za kućnu primenu; svetlost odgovarajuće talasne dužine uz sistemsku primenu boje pretvara izlaganje koje bi inače bilo modulaciono u fotohemiju posredovanu fotosenzibilizatorom, što pripada kliničkoj praksi.