Merenje mitohondrijalnih efekata metilenskog plavog: kiseonik, ATP i membranski potencijal

Pretpostavimo da laboratorija doda metilensko plavo mitohondrijama s poremećenom respiracijom i uoči porast potrošnje kiseonika. Prirodno bi bilo napisati da je boja obnovila mitohondrijalnu funkciju. Ta rečenica može biti pogrešna. Protok kiseonika, sinteza ATP-a i membranski potencijal tri su različita pojma. Zajednička im je ista organela, kao što rezervne kopije, sinhronizacija i deljenje koriste isti direktorijum u oblaku: povezani su, ali podležu različitim pravilima. Ako jedno zamenite drugim, tumačenje neće biti valjano, čak i kada je svako merenje tehnički ispravno.

Metilensko plavo povećava verovatnoću takve zabune jer učestvuje u sistemu koji meri. To je jedinjenje koje prolazi kroz redoks cikluse, prihvatajući elektrone ranije i predajući ih kasnije duž lanca, lipofilni katjon koji se nakuplja u energetski aktivnim mitohondrijama i izrazito plavo jedinjenje koje apsorbuje i emituje svetlost u istim opsezima kao uobičajene sonde. Jedno očitavanje ne može obuhvatiti sve to. Pouzdan pristup, prikazan u budimpeštanskim studijama mitohondrija, jeste merenje protoka kiseonika zajedno s brzinom sinteze ATP-a, membranskim potencijalom i oslobađanjem vodonik-peroksida, uz kontrole specifične za boju u svakom koraku.

Respirometrija meri protok kiseonika, a ne proizvodnju energije

Respirometrija visoke rezolucije, bilo pomoću uređaja Oroboros Oxygraph ili analizatora ekstracelularnog protoka Seahorse, daje podatak o jednoj stvari: koliko se brzo kiseonik redukuje. Ona ne pokazuje koliko je protona preneto po elektronu, koliko je gradijenta očuvano niti da li ga je ATP-sintaza iskoristila.

Terminologija je važna. U izolovanim mitohondrijama supstrat bez ADP-a daje respiraciju usled propuštanja protona, supstrat sa zasićujućom koncentracijom ADP-a daje kapacitet oksidativne fosforilacije, a titracija agensa za razdvajanje daje maksimalni kapacitet prenosa elektrona. U intaktnim ćelijama odgovarajući parametri sistema Seahorse jesu bazalna respiracija, respiracija povezana s ATP-om osetljiva na oligomicin, propuštanje protona, maksimalna respiracija definisana FCCP-om i nemitohondrijalna potrošnja kiseonika otporna na rotenon i antimicin. Nazivanje rezultata sistema Seahorse stanjem 3 i stanjem 4 pripisuje im preciznost koju takav preparat ne omogućava, što jasno pokazuje okvir testa Agilent Mito Stress Test.

Metilensko plavo prekida intuitivnu vezu između više kiseonika i više energije. U izolovanim mitohondrijama mozga zamorca, boja u koncentraciji od 100 nM do 1 uM povećala je potrošnju kiseonika u mirovanju uz glutamat i malat, sukcinat i alfa-glicerofosfat kao supstrate, s porastom od približno 64 procenata uz alfa-glicerofosfat, dok je respiracija stimulisana ADP-om u zdravim mitohondrijama ostala praktično nepromenjena, prema studiji izolovanih mitohondrija mozga. Pošto je respiracija usled propuštanja porasla, a protok stimulisan ADP-om ostao isti, izračunati odnos respiratorne kontrole opada. Taj pad ne znači da je boja oštetila mitohondrije. On znači da je boja normalnoj respiraciji dodala redoks ciklus koji troši kiseonik. Test potrošnje kiseonika uz metilensko plavo koji beleži samo porast izmerio je stvarnu hemijsku aktivnost, ali nije rekao ništa o očuvanju energije.

Eksperimenti obnove funkcije pokazuju isti raskorak u većem obimu. Kada je kompleks I blokiran, protok kiseonika oporavio se približno trostruko, dok se sinteza ATP-a oporavila samo približno 1.5 puta. Više kiseonika stiglo je do elektrode. Manji deo tog kiseonika doprineo je proizvodnji ATP-a. Svaka tvrdnja o poboljšanoj oksidativnoj fosforilaciji mora uključiti i podatke o ATP-u, idealno izražene kao odnos ATP-a i kiseonika, uz navedenu konvenciju za imenilac.

Testovi za ATP mere brzinu sinteze, koju sadržaj ne može zameniti

Test za ATP odgovara na drugo pitanje: koliko ATP-a nastaje po jedinici vremena. Kinetičko očitavanje, bilo praćenjem luminescencije luciferaze svitaca tokom više minuta ili spregnutim testom heksokinaze i glukoza-6-fosfat-dehidrogenaze koji se očitava na 340 nm, daje brzinu. Jedno merenje ukupnog ATP-a u krajnjoj tački daje sadržaj, koji odražava sintezu umanjenu za potrošnju i sam po sebi malo govori o oksidativnoj fosforilaciji.

Budimpeštanska grupa koristila je spregnutu enzimsku metodu uz inhibiranu adenilat-kinazu i utvrdila da metilensko plavo u koncentraciji od 1 do 2 uM umereno, ali značajno povećava proizvodnju ATP-a u mitohondrijama tretiranim rotenonom i antimicinom. To je stvarna, ali delimična obnova funkcije. Studija toksičnosti TEGDMA dala je sličan odgovor u drugom modelu: 5 mM dentalnog monomera TEGDMA smanjilo je respiraciju povezanu s kompleksom I s približno 286 na 28 jedinica protoka, a 2 uM boje povećalo ju je na približno 86.

Kod obojenog redoks jedinjenja dve kontrole su obavezne. Prvo, primenite oligomicin da biste utvrdili koliki deo izmerene sinteze ATP-a zavisi od ATP-sintaze. Drugo, u bezćelijskom sistemu proverite povrat poznate dodate količine ATP-a uz kompletan reagens i tačne koncentracije boje korišćene u eksperimentu, najmanje 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM i 2 uM. Boja može apsorbovati emitovanu svetlost, inhibirati reporterski enzim ili promeniti redoks hemiju reagensa, a opšte smernice za testove s luciferazom preporučuju biohemijske kontratestove upravo za ovu vrstu interferencije. Nemojte pretpostavljati da pri 1 uM nema artefakata samo zato što je gašenje obično izraženije pri višim koncentracijama.

Sonde za membranski potencijal mere raspodelu boje, a ne protok

Safranin O, TMRM i TMRE, rodamin 123 i JC-1 jesu katjoni koji prolaze kroz membranu. Nakupljaju se u negativno naelektrisanom matriksu prema elektrohemijskoj ravnoteži, pa ukupna fluorescencija posredno pokazuje potencijal preko raspodele sonde. Nijedna od njih ne meri ATP niti protok elektrona.

Za svaku sondu postoji najpogodniji tip preparata. Safranin O odgovara izolovanim mitohondrijama i permeabilizovanim ćelijama, obično pri približno 2 uM, uz ekscitaciju blizu 495 nm i emisiju blizu 585 nm, u režimu gašenja u kojem preuzimanje sonde menja ukupnu fluorescenciju. TMRM i TMRE odgovaraju intaktnim ćelijama pri unošenju u niskim nanomolarnim koncentracijama, u režimu bez gašenja, gde depolarizacija oslobađa boju i mitohondrijalna fluorescencija opada; pri visokom unosu smer signala može se obrnuti zbog samogašenja. JC-1 daje praktičan odnos zelene i crvene fluorescencije, ali zavisi od unosa sonde i mitohondrijalne mase, što ga čini slabijim izborom za kvantitativni rad od pažljivo kontrolisanog TMRM-a. Ove prednosti i ograničenja sažeti su u često korišćenom pregledu sondi za mitohondrijalni membranski potencijal.

Metilensko plavo izaziva optičke interferencije upravo pri radnim koncentracijama. Njegovi apsorpcioni opsezi blizu 600 do 665 nm preklapaju se s crvenom emisijom sondi, pa su efekti unutrašnjeg filtera, gašenje i apsorpcija ekscitacione svetlosti realne mogućnosti. Boja je ujedno drugi lipofilni katjon čija se sopstvena raspodela menja s potencijalom koji se meri. Zaštitu pružaju višestruka merenja i slepe probe: samo sonda, samo boja, sonda sa svakom koncentracijom boje, potpuna depolarizacija pomoću FCCP-a kao nulta referenca i, idealno, druga optički različita sonda. Studija zaobilaženja kompleksa III postavila je taj presedan ponavljanjem merenja obnove membranskog potencijala sa safraninom O i TMRM-om nakon inhibicije antimicinom i miksotiazolom, uz isti kvalitativni oporavak. Jedan optički reporter daje nagoveštaj. Dva nezavisna reportera daju dokaz.

Tri tipa preparata, tri različita pitanja

Izolovane mitohondrije, permeabilizovane ćelije i intaktne ćelije nisu međusobno zamenljiva podešavanja osetljivosti jednog testa. To su različiti koncepti s različitim principima rada.

Izolovane mitohondrije zadržavaju lanac prenosa elektrona, unutrašnju membranu i funkcionalni aparat matriksa, dok se plazma membrana, citosol i mrežna organizacija uklanjaju. Upravo je to svrha izolacije: supstrati, ADP, inhibitori i koncentracije boje tačno su definisani, pa se može utvrditi koji je put uključen. Cena je gubitak prirodnog snabdevanja supstratima, signalizacije i energetskih potreba.

Permeabilizovane ćelije zadržavaju mitohondrije u velikom delu njihove ćelijske strukture, a istovremeno omogućavaju prolazak egzogenih supstrata i ADP-a kroz otvorenu plazma membranu. One su odgovarajući alat za utvrđivanje poremećaja puta određenog supstrata u ćelijskom kontekstu. Prekomerna permeabilizacija oštećuje spoljašnju membranu, a citosolna regulacija se gubi ispiranjem.

Intaktne ćelije zadržavaju sve: barijeru plazma membrane, citosolne reduktante, transport endogenih supstrata, mitohondrijalnu mrežu i potrebe za ATP-om. One su najbliže fiziologiji i najudaljenije od izolovanog mehanizma, jer preuzimanje, redukcija i zadržavanje boje zajedno oblikuju efektivnu izloženost mitohondrija.

Studija TEGDMA namerno je koristila sva tri nivoa: izolovane mitohondrije mozga za ispitivanje obnove oksidacije i potencijala pomoću boje, permeabilizovane matične ćelije zubne pulpe uglavnom za lokalizaciju oštećenja na oksidaciju supstrata povezanu s kompleksom I, a intaktne matične ćelije za fiziološki neto efekat 2 uM boje na smanjenu potrošnju kiseonika. Čitaocima koji porede mitohondrijalna očitavanja između različitih preparata, prateći tekst o tome kako metilensko plavo prenosi elektrone kroz respiratorni lanac pruža osnovu o tim putevima, dok vodič za tumačenje studija respiracije uz metilensko plavo objašnjava logiku koncentracija i inhibitora.

Kontrole koje zahteva redoks-aktivna boja

Jedinjenju koje prolazi kroz redoks cikluse potreban je duži spisak kontrola nego običnom inhibitoru, jer hemijske reakcije same boje mogu oponašati biološke procese.

Za respirometriju koristite komoru samo s puferom radi provere pomeranja osnovnog signala, komoru s puferom i bojom bez biološkog materijala, boju sa svakim ekstracelularnim reduktantom prisutnim u testu i, na kraju, rotenon i antimicin radi određivanja nemitohondrijalne potrošnje kiseonika u intaktnim ćelijama. Imajte u vidu da se redukovana boja ponovo oksiduje prenoseći elektrone na kiseonik uz stvaranje vodonik-peroksida, pa slepa proba sa samom bojom bez donora elektrona potcenjuje bezćelijsku potrošnju kiseonika koja se javlja kada NADH ili NADPH postanu dostupni.

Za vodonik-peroksid dajte prednost kalibrisanom sistemu Amplex UltraRed s peroksidazom iz rena u odnosu na neselektivne boje DCFDA, proverite rezultate katalazom i testirajte zavisnost od osvetljenja, jer je boja fotosenzibilizator. Studija mitohondrija mozga utvrdila je da je opterećenje peroksidom poraslo više od četvorostruko već pri 100 nM boje, uz usporenu eliminaciju, pri čemu je peroksid nastajao direktno iz redukovane boje bez superoksida kao međuproizvoda. Detalji izbora sonde i kontrola osvetljenja nalaze se u pratećem tekstu o merenju reaktivnih kiseoničnih vrsta u eksperimentima s bojama, a šire pitanje kada peroksid deluje kao signal, a kada kao opterećenje, obrađeno je uz ćelijsku redoks ravnotežu i tvrdnje o antioksidativnom delovanju.

Za tvrdnje o putevima testirajte oba mesta inhibicije kompleksa III: antimicin A na mestu Qi i miksotiazol na mestu Qo, kao i završnu tačku na kompleksu IV pomoću cijanida. Ranija studija mozga miša zabeležila je da boja obnavlja respiraciju blokiranu rotenonom, ali ne i antimicinom, dok je kasnija studija na tri vrste utvrdila delimičnu obnovu uz oba inhibitora i dokaze o direktnoj redukciji citohroma c. Posmatrajte zaobilaženje kao mogućnost saglasnu s novijim podacima, a ne kao konačno utvrđen mehanizam, jer koncentracija boje, mesto delovanja inhibitora, stanje supstrata i raspodela boje menjaju uočeni put.

Matrica izbora testova

Koristite ovu tabelu da biste izabrali merenje prema pitanju, a ne obrnuto.

Minimalno uverljiva tvrdnja zahteva ispitivanje istih koncentracija boje, 100 nM, 300 nM, 1 uM i 2 uM, kroz merenja protoka kiseonika u uslovima propuštanja, uz ADP, oligomicin i agens za razdvajanje, brzine sinteze ATP-a, membranskog potencijala po mogućnosti s dve sonde i kalibrisanog oslobađanja peroksida uz katalazu i bezćelijske kontrole. Prikažite povezani skup podataka: protok kiseonika, brzinu sinteze ATP-a, ATP po kiseoniku, potencijal i peroksid. Bilo koji od tih brojeva sam za sebe jeste merenje koje tek treba da dobije značenje.