Metilensko plavo i azot-monoksid: NOS, cGMP, vaskularna signalizacija

Pitanje zvuči jednostavno: da li metilensko plavo inhibira azot-monoksid? U laboratoriji se odgovor razdvaja na četiri zasebna pitanja, a svako zahteva drugačiju eksperimentalnu proveru. Njihovo mešanje glavni je razlog što tekstovi o metilenskom plavom i azot-monoksidu zvuče samouvereno, ali neodređeno.

Zamislite signal azot-monoksida kao lanac sa četiri karike. Gen se transkribuje da bi nastala sintaza azot-monoksida. Enzim pretvara arginin u azot-monoksid. Gas difunduje do svoje mete pre nego što reaguje sa nečim drugim. Rastvorljiva gvanilat-ciklaza ga detektuje i stvara ciklični GMP. Objavljeni su efekti metilenskog plavog na svakoj karici, ali dokazi potiču iz različitih preparata, pri različitim koncentracijama i sa različitim izoformama. Rezultat na jednoj karici ne dokazuje delovanje na drugoj.

Kanonski lanac, jednostavno objašnjen

U zidu krvnog suda standardni sled izgleda ovako. Stimulus deluje na endotelnu ćeliju. Endotelna sintaza azot-monoksida, nazvana eNOS ili NOS3, stvara mali puls azot-monoksida. Gas difunduje u susednu glatkomišićnu ćeliju, vezuje se za hem sa redukovanim gvožđem rastvorljive gvanilat-ciklaze i ubrzava pretvaranje GTP u ciklični GMP. Ciklični GMP aktivira protein-kinazu G, menja se regulacija kalcijuma i mišić se opušta.

Postoji i drugi lanac koji treba posmatrati odvojeno. Tokom infekcije ili izlaganja citokinima, ćelije transkribuju gen za drugi enzim, inducibilnu sintazu azot-monoksida ili iNOS, koja se naziva i NOS2. Ona proizvodi veće i dugotrajnije tokove azot-monoksida nego eNOS. Treća izoforma, neuronska NOS ili nNOS, pripada još jednom kontekstu. Kada se u radu navodi sintaza azot-monoksida bez preciziranja izoforme, zastanite i proverite koja je merena. Pregled načina na koji metilensko plavo prenosi elektrone ističe isto načelo za redoks mete uopšte: prenosnik sam po sebi ne radi ništa, a partner na svakom kraju određuje ishod.

Izmereni ciklični GMP takođe je zbirni pokazatelj, a ne direktan test aktivnosti enzima. Njegov nivo odražava sintezu koju obavlja ciklaza umanjenu za razgradnju koju obavljaju fosfodiesteraze, naročito PDE5 u glatkim mišićima krvnih sudova. Pad cikličnog GMP zato znači da je do detektora stiglo manje signala. Sam po sebi ne pokazuje koja je karika zakazala.

Karika 1: stvara se manje enzima iNOS

U mišjim makrofagima stimulisanim bakterijskim lipopolisaharidom, interferonom gama ili oboma, metilensko plavo sprečilo je očekivani porast proteina iNOS i snažno potisnulo informacionu RNK za iNOS u eksperimentima transkripcije u makrofagima. Važno je ono što se nije promenilo. Razgradnja inhibitora I kapa B alfa, fosforilacija NF kapa B i STAT1, kao i prelazak tih faktora u jedro ostali su uglavnom nepromenjeni. Smanjilo se njihovo vezivanje za DNK, što je potvrđeno imunoprecipitacijom hromatina koja je pokazala smanjenu zauzetost promotora iNOS.

To je efekat regulacije gena koji prethodi promeni količine enzima, a ne akutna blokada već postojećeg enzima. Pripada inflamatornoj signalizaciji, u kojoj transkripcioni faktori moraju da se vežu za promotor pre nego što se protein pojavi. Ne govori ništa direktno o konstitutivnoj eNOS u krvnom sudu u stanju mirovanja i treba ga opisivati upravo u tim okvirima.

Karika 2: postojeći enzim NOS radi sporije

Jedna studija na pacovima ispitivala je drugi nivo. Svesni mužjaci pacova primili su lipopolisaharid intravenski, a zatim tri sata kasnije fiziološki rastvor ili metilensko plavo u količini od 3 mg po kg intravenski. Aktivnost sintaze azot-monoksida u medijalnom bazalnom hipotalamusu merena je pretvaranjem obeleženog arginina u citrulin u studiji aktivnosti hipotalamičke NOS. Sam stres uz fiziološki rastvor izazvao je određenu aktivnost nezavisnu od kalcijuma, a lipopolisaharid ju je povećao na približno deset puta veći nivo od kontrolnog. Metilensko plavo uklonilo je obe indukovane komponente. Konstitutivna aktivnost zavisna od kalcijuma nije se promenila u tom tkivu, pri toj dozi i u tom vremenskom trenutku.

Taj rezultat čitajte tačno onako kako je naveden: potisnuta je izmerena aktivnost tipa iNOS u tim uslovima. To nije merenje ekspresije gena niti dokaz trajne selektivnosti za iNOS u odnosu na eNOS ili nNOS. Rad sa prečišćenim enzimima dodatno naglašava potrebu za oprezom. U direktnim testovima prečišćene sintaze azot-monoksida, metilensko plavo potpuno je blokiralo stvaranje citrulina pri 30 mikromolara, uz koncentraciju za polovinu maksimalne inhibicije od približno 5.3 mikromolara bez superoksid-dismutaze i 9.2 mikromolara uz nju, kako je navedeno u poređenju prečišćene NOS i gvanilat-ciklaze. Zasebna studija prečišćene nNOS ukazala je na ulogu oksidacije hema vezanog za enzim. Praktična pouka je da direktna inhibicija NOS zaista postoji u izolovanim sistemima, ali rezultat iz hipotalamusa ne može se proširiti na opštu tvrdnju da metilensko plavo svuda pošteđuje sve konstitutivne NOS.

Karika 3: azot-monoksid se gubi pre nego što stigne

Najjasniji dokaz da pad cikličnog GMP može da objasni nešto drugo osim blokade enzima potiče iz kultivisanih glatkomišićnih ćelija plućne arterije kunića. Eksperimentalni pristup potpuno je zaobišao endogenu NOS direktnim dodavanjem donora azot-monoksida, a zatim je provereno da li metilensko plavo i dalje potiskuje odgovor cikličnog GMP u studiji superoksida u vaskularnim glatkim mišićima.

Ispitana su tri donora u rasponu od 1 do 100 mikromolara: S-nitrozo-L-cistein, natrijum-nitroprusid i stabilni deaminovani analog nazvan MPANO. Svi su povećali ciklični GMP približno od 1.5 do 12 puta. Metilensko plavo pri 10 mikromolara inhibiralo je odgovor na prva dva za 51 do 100 procenata, dok je odgovor na MPANO ostao nepromenjen. Kada bi metilensko plavo samo blokiralo katalitičko mesto ciklaze, takvu selektivnost prema donorima bilo bi teško objasniti, jer sva tri deluju preko istog nizvodnog enzima.

Tri kontrolne provere zatim su precizno povezale mehanizam sa superoksidom. Prvo, stvaranje vanćelijskog superoksida pomoću ksantina i ksantin-oksidaze ponovilo je isti obrazac: odgovori na CYSNO i nitroprusid bili su blokirani, a odgovor na MPANO pošteđen. Drugo, metilensko plavo izazvalo je stvaranje superoksida u glatkomišićnim ćelijama zavisno od doze i vremena, mereno redukcijom citohroma c. Treće, superoksid-dismutaza potpuno je sprečila inhibiciju, dok katalaza nije, što ukazuje na superoksid, a ne na vodonik-peroksid, kao neposredno odgovornu hemijsku vrstu u tom preparatu.

Vredi opisati i verziju eksperimenta sa kokulturom jer ona prostorno određuje mesto efekta. Endotelne ćelije na pokrovnim stakalcima kratko su kokultivisane sa glatkomišićnim ćelijama, pa je bazalno oslobođeni endotelni faktor povećao ciklični GMP u glatkim mišićima tri do osam puta. Prethodni tretman bilo kog od ta dva odeljka metilenskim plavim smanjio je taj signal, a superoksid-dismutaza delimično je poništila efekat prethodnog tretmana endotela. Drugim rečima, metilensko plavo uopšte ne mora da deluje unutar glatkomišićne ćelije koja detektuje signal. Može da smanji signal uklanjanjem glasnika tokom prenosa. Vodič za čitanje istraživanja o metilenskom plavom tretira ovo kao opšte pravilo: navedite odeljak u kojem je sprovedena intervencija pre nego što navedete molekularnu metu.

Bilo bi pogrešno nazvati ovo inhibicijom NOS. Za delovanje donora nije bio potreban korak sa sintazom, a signal je ipak opao.

Karika 4: sam detektor slabije reaguje

Direktni efekti na rastvorljivu gvanilat-ciklazu postoje, ali koncentracije su važne. U gore navedenom poređenju prečišćenih enzima, ciklazi stimulisanoj azot-monoksidom bilo je potrebno približno 60 mikromolara metilenskog plavog za polovinu maksimalne inhibicije, naspram približno 5 do 9 mikromolara za NOS, a čak je i 1 milimolar doveo samo do delimične maksimalne blokade. To je približno šestostruka do jedanaestostruka razlika. Zato se ćelijski eksperiment pri niskim mikromolarnim koncentracijama u kojem opada ciklični GMP ne može označiti kao selektivna inhibicija ciklaze samo na osnovu vrednosti cikličnog GMP.

Kasnija redoks studija dodala je još jedan razlog za oprez: metilensko plavo deaktiviralo je ciklazu aktiviranu azot-monoksidom mehanizmom koji se razlikuje od jednostavne oksidacije gvožđa u hemu vazduhom. Dakle, funkcija detektora može biti narušena, ali hemijski mehanizam nije razjašnjen, a razlika u koncentracijama znači da pri izlaganju niskim mikromolarnim koncentracijama prvo treba isključiti efekte superoksida i NOS. Ovde pripada i kontrola uloge fosfodiesteraza. Ako razgradnja nije merena ili blokirana, smanjeno nakupljanje cikličnog GMP može odgovarati manjoj sintezi, bržoj razgradnji ili oboma.

Zašto se ovo ne može svesti na jednu tvrdnju o krvnom pritisku

Svaka karika utvrđena je u različitom sistemu. Transkripcija u makrofagima nije aktivnost enzima u hipotalamusu. Aktivnost u hipotalamusu nakon lipopolisaharida nije endotelni tonus u mirovanju. Bazalno oslobođeni endotelni faktor u kokulturi nije vazodilatacija stimulisana agonistom. Kultivisane ćelije plućne arterije pri 10 mikromolara metilenskog plavog nisu ljudska cirkulacija. Svođenje svega na tvrdnju poput „metilensko plavo povećava krvni pritisak blokiranjem azot-monoksida“ odbacuje upravo one razlike čijem su očuvanju kontrolne provere bile namenjene.

Tri provere održavaju tumačenje preciznim. Prvo, navedite izoformu: eNOS za vaskularni tonus u mirovanju, iNOS za indukovani inflamatorni tok, nNOS za neuronske kontekste i neke eksperimente sa prečišćenim enzimima. Drugo, navedite kako je signal azot-monoksida dopremljen: endogenom sintezom, bazalnim oslobađanjem iz endotela ili određenim donorom kao što su CYSNO, nitroprusid ili MPANO, jer je stabilni donor bio otporan na metilensko plavo, dok labilni nisu. Treće, navedite koncentraciju i način poništavanja efekta: poništavanje efekta pomoću superoksid-dismutaze ukazuje na ulogu superoksida, izostanak efekta katalaze govori protiv uloge vodonik-peroksida u tom preparatu, oponašanje pomoću ksantin-oksidaze pokazuje da je stvaranje superoksida dovoljno za taj efekat, a testovi sa prečišćenim enzimima razdvajaju direktne efekte na katalizu od gubitaka tokom prenosa.

Sažeti zaključak je sledeći. Metilensko plavo je bolje posmatrati kao supstancu koja remeti signalizaciju od azot-monoksida do cikličnog GMP na više mesta nego kao selektivni blokator ciklaze. U zavisnosti od preparata i koncentracije, ono može da smanji vezivanje transkripcionih faktora za iNOS, direktno inhibira enzime NOS, smanji dostupnost azot-monoksida stvaranjem superoksida i naruši funkciju ciklaze aktivirane azot-monoksidom. Uloga signalizacije cikličnim GMP u vaskularnim studijama i poređenje donora azot-monoksida korišćenih u ćelijskim testovima detaljnije obrađuju po jednu od tih grana, a metode za razdvajanje redoks efekata od efekata na enzime objašnjavaju zašto se kombinacija superoksid-dismutaze, katalaze i kontrole sa stabilnim donorom tako često pojavljuje u ovoj literaturi.

Niska vrednost cikličnog GMP nakon metilenskog plavog ukazuje na prekinut lanac. Samo kontrolne provere pokazuju koja je karika prekinuta.