Metilensko plavo i ćelije koje podržavaju mozak: astrociti, mikroglija i zapaljenje

Zamislite da sprovedete dva eksperimenta sa istom plavom bojom i dobijete dva ohrabrujuća rezultata. U jednoj posudi, zvezdaste potporne ćelije preživljavaju uskraćivanje kiseonika i glukoze. U drugoj, imunske ćelije mozga zadržavaju svoj miran, razgranat oblik uprkos bakterijskom toksinu. Primamljivo je spojiti ta dva rezultata u jednu tvrdnju: boja smiruje zapaljenje u mozgu i štiti mozak. Upravo pri tom spajanju pažljivi čitaoci treba da zastanu.

Mozak ima dve populacije potpornih ćelija sa različitim ulogama, a metilensko plavo se ispituje na svakoj od njih uz drugačiji eksperimentalni okidač. Astrociti su ćelije koje pružaju metaboličku podršku. Nalaze se između krvnih sudova i neurona, uklanjaju višak glutamata, održavaju ravnotežu kalijuma, skladište glikogen i prenose gorivo neuronima kada potrebe naglo porastu. Mikroglija je stalni imunski nadzornik. Njeni tanki nastavci nadziru tkivo, prepoznaju bakterijske signale i signale oštećenja, a pri uzbuni se povlače u zaobljen ameboidni oblik prilagođen migraciji i fagocitozi, uz oslobađanje signalnih molekula. Rezultat dobijen u jednoj populaciji ne prenosi se na drugu, a merenje primenjeno u svakom slučaju određuje šta je zapravo pokazano.

Astrociti pod metaboličkim stresom: ključni rezultat je vreme primene

Eksperiment sa astrocitima počinje uskraćivanjem. Istraživači su uzgajali kortikalne astrocite novorođenih miševa, uklonili glukozu i gotovo sav kiseonik tokom šest sati, a zatim ih ponovo obezbedili tokom dvadeset četiri sata — laboratorijski model moždanog udara praćenog reperfuzijom. Kada je metilensko plavo bilo prisutno tokom faze uskraćivanja, preživljavanje ćelija se pogoršalo. Kada je dodato samo tokom faze reoksigenacije, u koncentracijama od 0.1 i 1 mikromolar, preživljavanje se značajno poboljšalo prema testu vijabilnosti pomoću kalceina. Studija na mišjim astrocitima opisuje ovu razliku povezanu s vremenom primene zajedno sa podacima o ćelijskom disanju.

Ta razlika je najvažniji nalaz. Tokom uskraćivanja gotovo da nema kiseonika koji bi prihvatio elektrone, pa prenosilac elektrona nema gde da ih preda. Tokom reoksigenacije ćelijski mehanizmi ponovo počinju da rade i boja može da obavi svoju ulogu. Tretirani astrociti trošili su više kiseonika, preuzimali više glukoze, proizvodili više ATP i obnavljali zalihe glikogena, uz veću aktivnost heksokinaze i bez porasta mitohondrijskog superoksida. Predloženo objašnjenje je ono poznato iz prikaza metilenskog plavog kao mitohondrijskog prenosioca elektrona: prenosi elektrone mimo blokiranih tačaka u respiratornom lancu, tako da se ćelijsko disanje ponovo pokreće bez gubitka elektrona koji bi doveli do nastanka reaktivnih vrsta.

Obratite pažnju na vrstu dokaza. Ovo je rezultat koji se odnosi na preživljavanje i metabolizam jednog izolovanog tipa ćelija, sa jasno utvrđenim periodom u kojem je primena delotvorna (oporavak, a ne uskraćivanje) i navedenim rasponom koncentracija. Ne govori ništa o imunskoj signalizaciji, niti o ponašanju.

Mikroglija pod bakterijskom uzbunom: reprogramiran metabolizam

Eksperimenti sa mikroglijom počinju suprotnim okidačem: ne gladovanjem, već lažnim signalom infekcije. Lipopolisaharid, fragment spoljašnje membrane bakterija, vezuje se za senzore urođenog imuniteta i navodi mikrogliju da reaguje kao da su patogeni stigli, iako nema živih bakterija. Kod miševa kojima je dat lipopolisaharid i u kultivisanoj ćelijskoj liniji mikroglije, rezultat je poznat zapaljenski program: raste nivo proinflamatornih faktora, mikroglija se polarizuje ka agresivnom stanju M1, susedni neuroni umiru, a životinje postižu lošije rezultate na zadacima učenja i pamćenja.

Studija ovog odgovora kod miševa povezuje ga sa signalnim putem koji registruje kiseonik: lipopolisaharid podstiče prekomernu ekspresiju PHD3, jednog od tri enzima prolil-hidroksilaze, preko uzvodnog lanca Siah2/Morg1. Istovremeno, ćelije reprogramiraju korišćenje energije ka aerobnoj glikolizi uz povećane nivoe mitohondrijskih reaktivnih kiseoničnih vrsta, što su autori direktno izmerili metaboličkim testovima Seahorse koji prate potrošnju kiseonika i ekstracelularno zakiseljavanje. Metilensko plavo je preokrenulo i metabolički pomak i prekomernu ekspresiju PHD3, smanjilo nivo zapaljenskih faktora, smanjilo odumiranje neurona i poboljšalo rezultate testova ponašanja. Pozitronska emisiona tomografija dodala je podatke dobijene snimanjem: lipopolisaharid je povećao preuzimanje glukoze u hipokampusu na FDG-PET snimcima, a tretman ga je ponovo smanjio, što je u skladu sa smirenijim zapaljenskim metabolizmom u živom mozgu.

Ovo je bogatiji skup merenja nego u studiji sa astrocitima (citokini, metabolizam, snimanje, ponašanje životinja), ali se odnosi na drugačiji okidač i drugačiju ćeliju. Čitaoci koji porede ove dve studije treba da razdvoje okidače: jedna studija spasava potporne ćelije izložene gladovanju tokom oporavka, a druga ublažava lažnu uzbunu zbog infekcije u imunskim ćelijama.

Mikroglija pod mikroskopom: oblik kao pokazatelj

Treći eksperiment posmatra istu bakterijsku uzbunu isključivo kroz oblik ćelija. U glijalnim kulturama iz korteksa pacova, kontrolne ćelije mikroglije obojene radi prikaza markera IBA1 imaju mnogo tankih nastavaka, odnosno razgranat oblik karakterističan za nadzor tkiva. Posle dvadeset četiri sata izlaganja lipopolisaharidu u koncentraciji od 10 mikrograma po mililitru, ćelije se spljoštavaju u ameboidni oblik, a površina njihovog ćelijskog tela raste dok obim ostaje približno isti, što je geometrijsko obeležje zaobljavanja. Metilensko plavo u koncentraciji od 1 mikromolar, dato zajedno sa toksinom, očuvalo je razgranate nastavke i održalo površinu i obim ćelijskog tela blizu kontrolnih vrednosti. Studija na kulturama ćelija pacova kvantifikuje ovo očuvanje oblika merenjima površine i obima ćelijskog tela.

Dva detalja daju ovoj studiji veću vrednost od same slike. Prvo, menadion, drugo redoks-aktivno jedinjenje korišćeno za poređenje u istoj koncentraciji, nije očuvao oblik, a sam je podsticao ćelije da pređu u aktivirani oblik, pa efekat nije opšte svojstvo svih molekula koji učestvuju u redoks ciklusima. Drugo, autori povezuju efekat boje sa aktivacijom Nrf2, transkripcionog faktora koji upravlja programom antioksidativnih i antiinflamatornih gena, a ne samo sa direktnim uklanjanjem reaktivnih vrsta. Povezani prikazi redoks i zapaljenske signalizacije stavljaju ovu vezu sa Nrf2 u kontekst.

Ipak, oblik je najslabiji od ova tri pokazatelja. Razgranata ćelija obično nadzire tkivo, a zaobljena ćelija obično je aktivirana, ali morfologija je posredni pokazatelj, a ne transkript. Ova kultura nije sadržala imunske ćelije iz krvi, neuronske mreže niti mogućnost praćenja ponašanja.

Uporedno čitanje tri rezultata

Obrazac koji se vidi u redovima jeste da svaki okidač ima svoje merenje i svoj odgovor. Oporavak metabolizma odgovara na pitanje o metabolizmu. Podaci o citokinima i ponašanju odgovaraju na pitanje o zapaljenju. Oblik odgovara na pitanje o obliku. Nijedan od ova tri rezultata sam po sebi ne prelazi te granice.

Šta mikroglija koja izgleda mirnije ne dokazuje

Čitava tema zahteva ovu rečenicu: mikroglija koja izgleda manje aktivirano ili ima izmenjen metabolizam sama po sebi ne dokazuje poboljšanu funkciju mozga.

Morfologija može da se promeni, a da se funkcija ne promeni zajedno s njom. Ćelija može da zadrži svoje nastavke i da i dalje oslobađa citokine, ili da se zaobli dok obavlja korisno uklanjanje ćelijskih ostataka. Metabolička merenja imaju isto ograničenje: zapis metode Seahorse ili PET snimak pokazuje kako se koristi energija, a ne kogniciju. Studija na miševima koja je uparila metaboličke pokazatelje i pokazatelje nalik morfološkim sa testovima ponašanja snažnija je upravo zato što je povezala više nivoa dokaza, umesto da od jednog merenja traži da podrži ceo zaključak. Čak i tu važe uobičajena ograničenja, jer lipopolisaharid modeluje sterilnu uzbunu, a ne stvarnu infekciju, miševi nisu ljudi, a i sami autori ističu razlike među vrstama. Svako ko planira dalja istraživanja treba da proceni koliko se nalazi o mikrogliji mogu preneti između modela pre nego što pretpostavi da se taj signalni put ponaša identično u ljudskom tkivu.

Iz toga sledi praktičan zaključak o vremenu primene. U eksperimentu sa astrocitima rana primena ima nepovoljan ishod, a primena tokom oporavka povoljan. Rezultati sa mikroglijom dobijeni su primenom približno u vreme delovanja zapaljenskog okidača. Oštećenje mozga u stvarnom životu istovremeno spaja obe faze: energetski zastoj i imunsku uzbunu, koji se menjaju tokom više sati. Eksperiment koji izoluje jednu fazu ne može da odredi raspored primene za kombinovani slučaj, zbog čega se u raspravama o vremenskim okvirima primene vremenski tokovi uskraćivanja i zapaljenja razmatraju odvojeno.

Pošten sažetak staje u jedan pasus. U izolovanim astrocitima, metilensko plavo dato tokom reoksigenacije ponovo pokreće ćelijsko disanje i spasava ćelije. U mikrogliji izloženoj bakterijskom fragmentu, ono preokreće zapaljenski metabolički program preko specifičnog signalnog puta PHD3 i čuva oblik karakterističan za stanje mirovanja. Svaki rezultat je stvaran u okviru svojih eksperimentalnih uslova, ali nijedan nije opšti sud o zapaljenju u mozgu. Poređenje glijalnih ćelija korisno je upravo zato što sprečava da se ove dve priče stope u jednu.