Metilensko plavo kao indikator anaerobnih uslova i kiseonika: šta promena boje dokazuje

Tehničarka zatvara anaerobnu posudu, proverava indikatorsku traku sa metilenskim plavim kroz poklopac i vidi ono što želi da vidi. Traka je iz plave prešla u belu. Beleži da su u postupku uspostavljeni anaerobni uslovi i nastavlja dalje. Dva dana kasnije na jednoj ploči nema rasta, dok zatvorena epruveta sa bujonom u istoj posudi pokazuje znake izloženosti kiseoniku. Traka je govorila istinu. Tehničarka joj je postavila pogrešno pitanje.

Zabuna nastaje zbog mešanja pojmova. Anaerobni indikator sa metilenskim plavim zasniva se na redoks procesima, a ne na proceni sterilnosti niti na validaciji celog sistema. Kada je ta razlika jasna, traka postaje precizan i pouzdan instrument sa usko definisanim zadatkom.

Osnovni princip: reverzibilni redoks par

Rastvoreno metilensko plavo postoji u dva stanja. Oksidovani oblik je poznati plavi katjon. Redukovani oblik, koji se naziva leukometilensko plavo, bezbojan je. Pri približno neutralnom pH, pojednostavljena polureakcija podrazumeva da jedan plavi katjon, jedan proton i dva elektrona daju jedan bezbojni leuko molekul. Formalni potencijal je približno plus 11 milivolti u odnosu na standardnu vodoničnu elektrodu pri pH 7, što ga smešta u opseg koji mnogi redukujući sistemi mogu dostići i u kom kiseonik može izazvati obrnutu reakciju.

Za redukciju je potreban nizak lokalni redoks potencijal. Samo uklanjanje kiseonika nije uvek dovoljno. Rana istraživanja anaerobnih uslova pokazala su da metilensko plavo u običnoj vodi bez kiseonika zadržava boju ako nije prisutna redukujuća supstanca i da se smeše dekstroznog bujona sa približno 0.01 procenata boje lako obezbojavaju pri 37 C, dok ista smeša držana pri 4 C ostaje plava tokom jednog dana, kako je opisano u eksperimentima sa svežim tkivom i anaerobnim uslovima kultivacije. Temperatura, pH, glukoza, askorbat, tioglikolat i redukujuća aktivnost mikroorganizama određuju dostupnost elektrona.

Za ponovnu oksidaciju potreban je samo kiseonik. Kada vazduh dospe do leuko oblika, on ponovo prelazi u plavi oblik. Savremeni namenski razvijeni indikatori koriste upravo ovaj ciklus: boja, redukujuće sredstvo i stabilizujuća matrica, bezbojni pri niskom sadržaju kiseonika i ponovo plavi pri izlaganju vazduhu, kao što je pokazano u hibridnom indikatoru kiseonika sa metilenskim plavim, zasnovanom na boji, redukujućem sredstvu, surfaktantu i glini. Taj prototip koristio je boju u koncentraciji od 0.01 milimolara sa 2.0 milimolara askorbata ili glukoze pri pH 11, postajao je bezbojan pri približno 0.5 zapreminskih procenata kiseonika i u ispitnoj komori razlikovao sadržaj kiseonika ispod 0.1 procenata od sadržaja iznad 0.5 procenata.

Dakle, princip rada je jednostavan. Plava boja znači da je zona indikatora oksidovana. Bezbojnost znači da su u zoni indikatora uspostavljeni redukujući uslovi sa niskim sadržajem kiseonika. Promena je reverzibilna, lokalna i hemijska. Sama po sebi ne govori ništa o mikroorganizmima.

Kako radi indikatorska traka sa metilenskim plavim u anaerobnoj posudi

Indikatorska traka sa metilenskim plavim za anaerobnu posudu predstavlja malu reakcionu zonu postavljenu u atmosferu posude tako da se može videti bez njenog otvaranja. Komercijalni oblici se razlikuju: papirne trake, tablete koje se rastvaraju ili vlaže pri pripremi i noviji hibridni papiri. Kod nekih je potrebna jedna kap destilovane vode za aktiviranje reakcione zone. Drugi su indikatori u suvom obliku koji moraju ostati suvi. Merodavno je uputstvo za konkretan proizvod, jer su vlaženje, položaj i vreme očitavanja deo hemijskog procesa.

Predviđeno očitavanje je u praksi binarno. Plava boja znači da su na traci i dalje prisutni kiseonik ili nedovoljno redukujući uslovi. Bela boja ili bezbojnost znače da su na traci uspostavljeni anaerobni redoks uslovi. Neki komercijalni papiri sadrže crveni pozadinski pigment, pa je njihovo krajnje stanje nakon redukcije ružičasto, a ne belo. Pre procene proverite koje krajnje stanje vaš proizvod treba da pokaže.

Vreme zavisi od sistema. U jednoj postavci tipa GasPak, boja je počela da bledi za približno sat vremena i potpuno nestala u roku od nekoliko sati, dok je u kontrolisanom poređenju na sobnoj temperaturi metilenskom plavom bilo potrebno više od šest sati. Redoks potencijal podloge u tom istraživanju dostigao je približno minus 100 milivolti za 60 do 100 minuta, znatno pre nego što je boja završila promenu, a do trenutka kada je traka postala potpuno bezbojna bio je znatno ispod minus 200 milivolti. Indikator kasni za promenama u atmosferi. Plava traka nakon jednog sata ne dokazuje neuspeh, a bela traka nakon šest sati opisuje stanje trake nakon šest sati.

Položaj je važan iz istog razloga. Držite traku u gasnom prostoru posude, vidljivu kroz poklopac, dalje od površina agara i podloga za kultivaciju. Ona pokazuje uslove u svom neposrednom okruženju. Ako je priljubite uz hladan zid, zatrpate ispod ploča ili dozvolite da je natopi kondenzat, pokazivaće stanje te mikrosredine umesto atmosfere posude.

Šta traka pokazuje, a šta ne

Posmatrajte indikator sa metilenskim plavim u anaerobnoj posudi kao jedan senzor na jednom mestu. On utvrđuje lokalne redoks uslove i uslove u pogledu kiseonika u sopstvenoj reakcionoj zoni, koji uglavnom odražavaju stanje gasnog prostora ako su mešanje i uspostavljanje ravnoteže odgovarajući. Sve izvan toga je zaključivanje, a za zaključivanje su potrebni zasebni dokazi.

Bezbojna traka ne potvrđuje sterilnost. Sterilnost je odsustvo živih organizama, dokazano validiranom sterilizacijom i kontrolama za validaciju kultivacije. Posuda može biti potpuno anaerobna, a ipak kontaminirana, ili potpuno sterilna, a ipak aerobna.

Ona ne potvrđuje odgovarajuće uslove u svakom delu sistema za kultivaciju. Rastvoreni kiseonik u zatvorenoj epruveti, kiseonik zarobljen duboko u agaru, gradijenti u prepunjenoj posudi i propuštanje koje nastane nakon očitavanja ostaju van dometa jedne trake. Eksperimenti sa prostornim rasporedom pokazali su susedne plave i bezbojne zone u istoj posudi, gde su prodor kiseonika i redukujuća aktivnost bili u različitoj ravnoteži. Jedna tačka ne može potvrditi stanje cele zapremine.

Ona ne dokazuje neprekidne anaerobne uslove. Traka očitana jednom pri pripremi ne govori ništa o stanju nakon dvadeset sati. Novija istraživanja kvaliteta anaerobnih uslova upozoravaju da hemijski indikatori opisuju atmosferu u trenutku očitavanja i mogu izgledati zadovoljavajuće uprkos maloj količini preostalog kiseonika. Kontinuirano dokumentovanje ili dokumentovanje na kontrolnim tačkama, a ne jedan pogled na krajnje stanje, povezuje očitavanje trake sa tokom inkubacije.

Za prateće objašnjenje hemije promene boje pogledajte kako metilensko plavo prelazi između oksidovanog i redukovanog stanja. Za širi pregled uticaja kiseonika na rukovanje uzorcima pogledajte kontrolu kiseonika u mikroskopiji i radu sa kulturama.

Dijagram koji treba držati pored posude

Slika ispod sažima članak u jedan pregled za radni sto. Tri stanja iste trake, dva smera reakcije i granica između dokaza koje pruža indikator i validacije sistema.

Uzroci problema zbog kojih traka ostaje plava ili daje lažan osećaj sigurnosti

Većina problema spada u pet grupa. Svaka ima prepoznatljiv obrazac.

Posuda ili vrećica koja propušta neprestano dovodi kiseonik do reakcione zone. Traka ostaje plava ili ponovo postaje plava nakon što izbledi. Proverite poklopac, zaptivku, stege i zaptivne površine pre nego što uzrok pripišete hemiji.

Istrošen ili nepravilno aktiviran generator gasa uopšte ne uklanja kiseonik. U starijim sistemima koji se aktiviraju vodom, izostanak kondenzacije nakon približno 10 do 15 minuta i izostanak zagrevanja poklopca nakon približno 20 do 40 minuta bili su rani znaci upozorenja za taj sistem. Kesica nedovoljnog kapaciteta u prepunjenoj posudi dovodi do istog problema.

Trovanje katalizatora odnosi se samo na starije sisteme sa vodonikom i paladijumom, u kojima paladijum omogućava spajanje vodonika i kiseonika u vodu. Vlaga i vodonik-sulfid ga oštećuju. Mnoge savremene kesice uopšte ne koriste paladijum, zato ovu meru ne primenjujte tamo gde nije relevantna.

Degradirana traka ili traka kojom se nepravilno rukuje otkazuje bez očiglednog upozorenja. Boja i redukujuće sredstvo tokom skladištenja gube sposobnost reverzibilne reakcije, što je jedan od razloga za razvoj hibridnih formulacija otpornih na bledenje pod uticajem svetlosti i gubitak svojstava tokom skladištenja. Odbacite zalihe kojima je istekao rok upotrebe, zalihe sa neuobičajenom početnom bojom i trake koje su nakvašene iako treba da budu suve ili ostavljene suve iako zahtevaju vlaženje.

Gradijent ili kašnjenje dovode u zabludu osobu koja očitava, a ne hemijski sistem. Slabo izmešan gasni prostor, zatvorene epruvete sa rastvorenim kiseonikom i polučvrste podloge zadržavaju sopstvene uslove duže nego što traka sugeriše. Trake sa resazurinom preko ružičaste boje prelaze u bezbojno stanje i često se reklamiraju kao brže, ali njihovi pragovi zavise od sopstvene formulacije i ne mogu se preneti na metilensko plavo.

Kontrole i protokol očitavanja koje vredi preuzeti

Dve jeftine kontrole otkrivaju većinu pogrešnih očitavanja. Uz postupak držite svežu kontrolnu traku izloženu sobnom vazduhu. Ispravna traka sa metilenskim plavim tu ostaje plava. Neki upakovani indikatori u početku su bledi, a pri otvaranju postaju plavi, što samo po sebi predstavlja funkcionalnu proveru. Takođe, povremeno postavite svežu traku u prethodno validiranu anaerobnu postavku. Trebalo bi da dostigne validirano krajnje redukovano stanje u roku navedenom za proizvod. Ako se bilo koja kontrola ne ponaša kako treba, zamenite seriju pre nego što počnete da se oslanjate na očitavanja u posudi.

Protokol očitavanja proizlazi iz mehanizma. Postavite traku u gasni prostor tako da je možete videti bez otvaranja posude, poštujući uputstvo za proizvod u pogledu dodira sa zidom i vlaženja. Zabeležite početnu boju, vreme zatvaranja posude i boju na kontrolnoj tački navedenoj za proizvod. Kada posuda to omogućava, zabeležite da je indikator ostao u redukovanom stanju na definisanim kontrolnim tačkama tokom inkubacije. Zabeležite konačnu boju neposredno pre otvaranja. Ta boja pre otvaranja predstavlja krajnji rezultat tog postupka. Nakon otvaranja očekujte ponovno pojavljivanje plave boje i ne dozvolite da ono promeni tumačenje prethodnog stanja.

Ako traka ostane plava nakon predviđenog vremena, smatrajte da anaerobni uslovi nisu potvrđeni. Proveravajte redom: zaptivanje, kesicu, katalizator ako postoji, vlaženje indikatora i rok upotrebe, a zatim funkcionalnost indikatora u odnosu na kontrolu na vazduhu. Tek kada je atmosfera proverena treba tumačiti rast ili odsustvo rasta, uz postavku za anaerobnu kultivaciju i kontrole mikroorganizama prilagođene nameni.

Traka zaslužuje poslednju reč u sopstvenom domenu. Plava ili bezbojna, odgovara na jedno pitanje o jednom mestu u jednom trenutku. Postavite joj to pitanje u predviđeno vreme, uz odgovarajuće kontrole, i odgovoriće pouzdano. Pitajte je o sterilnosti, o svakoj epruveti ili o celoj inkubaciji na osnovu jednog pogleda i nijedna hemija indikatora neće moći da spase takvo tumačenje.