Metilensko plavilo, Nrf2 i mitohondrijska biogeneza: objašnjenje

U tekstovima o metilenskom plavilu često se pojavljuje jedna rečenica: ono aktivira Nrf2 i stvara nove mitohondrije. Ta rečenica zvuči kao jedna tvrdnja, ali sadrži dva različita koncepta, proučavana u različitim sistemima, uz različite vrste dokaza. Prvi je signalni put, senzor koji uključuje odbrambene gene. Drugi je program izgradnje, kojim ćelija stvara više mitohondrijskog aparata. Signal može pokrenuti izgradnju, ali pokazati da je signal aktiviran nije isto što i pokazati da je zgrada podignuta, a pokazati da ima više građevinskog materijala nije isto što i pokazati da je snabdevanje energijom bolje. Ovaj članak razdvaja te tri stvari.

Koncept Nrf2: senzor, a ne štit

Nrf2 (nuklearni faktor 2 povezan sa eritroidnim faktorom 2) je transkripcioni faktor, protein čiji je zadatak da uključuje gene. U stanju mirovanja u citoplazmi ga zadržava senzorski protein Keap1, koji ga predaje ćelijskom aparatu za razgradnju, pa se on neprekidno razgrađuje. Kada oksidansi ili elektrofili izmene reaktivne cisteine na proteinu Keap1, razgradnja prestaje. Novonastali Nrf2 se nakuplja, prelazi u jedro, udružuje se sa malim Maf proteinima i vezuje za sekvence DNK koje se nazivaju elementi antioksidativnog odgovora. To vezivanje uključuje čitav niz odbrambenih gena.

Uobičajeni pokazatelji aktivnosti ovog puta su specifični. NQO1 (NAD(P)H hinon-dehidrogenaza 1) i TrxR1 (tioredoksin-reduktaza 1) spadaju među najpouzdanije ciljne gene Nrf2. HO-1 (hem-oksigenaza-1) može snažno da se indukuje, ali reaguje i na druge regulatore. Enzimi poput SOD i katalaze deo su antioksidativnog aparata, ali njihove nivoe kontrolišu mnogi transkripcioni faktori, pa porast SOD sam po sebi ne dokazuje da je uzrok bio Nrf2. Dokazi najbliži samom signalnom događaju jesu nakupljanje Nrf2 u jedru, aktivacija ARE reportera ili indukcija uobičajenih ciljnih gena koja nestaje kada se Nrf2 ukloni. Sve ostalo, niži nivoi oksidansa, bolje preživljavanje pod stresom, više glutationa, predstavlja nizvodne efekte koje mogu proizvesti mnogi putevi.

Najraniji nalaz o metilenskom plavilu u ovoj priči pripada delu te skale koji je bliži signalnom događaju. Fibroblasti izloženi nanomolarnim koncentracijama metilenskog plavila pokazali su odloženu senescenciju, uz veći sadržaj kompleksa IV, veću potrošnju kiseonika i indukciju enzima faze-2, TrxR1 i NQO1, kako je navedeno u studiji koja je prva povezala metilensko plavilo sa poboljšanjem mitohondrijske aktivnosti i odlaganjem senescencije. TrxR1 i NQO1 upravo su oni uobičajeni ciljni geni Nrf2 koje pažljiv čitalac želi da vidi. Studija, međutim, nije pokazala sam signalni događaj: nije bilo merenja Nrf2 u jedru, ARE reportera ni kontrolnog eksperimenta sa isključenim genom Nrf2. Zato je pošteno tumačenje da metilensko plavilo u ovom sistemu indukuje poznate ciljne gene Nrf2, što je u skladu sa aktivacijom Nrf2, ali ne izdvaja Nrf2 kao uzrok. Indukcija ciljnog gena nalazi se jedan korak nizvodno od prekidača.

Koncept biogeneze: program sa tri kontrolne tačke

Mitohondrijska biogeneza je program kojim ćelija povećava svoj mitohondrijski kapacitet. Njena udžbenička hijerarhija prolazi kroz tri kontrolne tačke. Prvo, koaktivator PGC-1alpha uključuje program. Drugo, nuklearni transkripcioni faktori (zbunjujuće je što se jedan zove NRF1, nuklearni respiratorni faktor 1, a to je protein različit od Nrf2) pokreću ekspresiju mitohondrijskih gena, uključujući TFAM, koji održava i umnožava mitohondrijsku DNK. Treće, ćelija na kraju ima više mitohondrijskih genoma i više respiratornog aparata, što se može meriti brojem kopija mtDNK, aktivnošću citrat-sintaze ili količinom i aktivnošću respiratornih kompleksa.

Svaka kontrolna tačka pruža slabiju ili jaču osnovu za tvrdnju od prethodne. Viši nivo informacione RNK za PGC-1alpha ili TFAM pokazuje da je program zatražen, a ne da je završen. Više mtDNK ili više proteina kompleksa IV pokazuje da ima više materijala, ali i preoblikovane mitohondrije mogu dati istu sliku. Bolja respiracija, veća potrošnja kiseonika ili veća aktivnost kompleksa pokazuju da se funkcija promenila, ali funkcija može da se poboljša i bez ikakvih novih mitohondrija. Snažna tvrdnja o biogenezi objedinjuje sva tri elementa: regulator, sadržaj i funkciju.

Naknadna studija na fibroblastima pratila je veći deo tog lanca. U ljudskim ćelijama IMR90 tretiranim metilenskim plavilom u koncentraciji od 100 nanomola po litru, odnos NAD prema NADH prolazno je porastao u roku od 15 minuta i vratio se na početni nivo u roku od jednog dana. Posle tog prolaznog energetskog signala usledila je prolazna fosforilacija energetskog senzora AMPK, zatim indukcija PGC-1alpha i SURF1, proteina potrebnog za sastavljanje funkcionalnog kompleksa IV. Aktivnost kompleksa IV približno se udvostručila, nivoi ćelijskih oksidansa opali su za oko 28 procenata, a telomere su se sporije skraćivale. Ceo niz prikazan je u radu koji povezuje redoks aktivnost metilenskog plavila sa AMPK i mitohondrijskom biogenezom.

Dva detalja u tom radu zaslužuju pažnju jer se upravo takvi detalji obično izostavljaju. Prvo, obrazac aktivacije bio je važniji od njenog prisustva: metilensko plavilo je prolazno uključivalo AMPK, dok ga je referentni lek AICAR uključivao hronično, a prolazni aktivator odlagao je senescenciju oko osam puta efikasnije. Tvrdnja „metilensko plavilo aktivira AMPK” zato je nepotpuna; ključna tvrdnja je da ga aktivira prolazno, a poređenje ukazuje da hronična aktivacija ne daje isti rezultat. Drugo, metilensko plavilo nije menjalo ćelijski ciklus, što isključuje najjednostavnije alternativno objašnjenje: da su se ćelije samo sporije delile i zbog toga izgledale mlađe.

Istraživanja na miševima: ponašanje, genomi i namerno paradoksalan okidač

Rad na ćelijskim kulturama proširila je na životinje grupa koja je proučavala miševe srednjeg životnog doba. Posle 60 dana oralnog davanja metilenskog plavila, tretirani miševi očuvali su veći deo fizičke izdržljivosti i istraživačkog ponašanja i pokazivali manje ponašanja nalik anksioznosti nego netretirani stari miševi. U moždanom tkivu, ekspresija gena koju je starenje potisnulo, NRF1, TFAM, SOD2 i podjedinice kompleksa IV COX1, vratila se ka nivoima kod odraslih jedinki, a broj kopija mtDNK je porastao. Ti rezultati, ponašanje uz regulator i količinu genoma, navedeni su u studiji o metilenskom plavilu i mitohondrijskoj biogenezi u mozgu miševa srednjeg životnog doba.

Predloženi okidač je zanimljiv deo priče, jer se suprotstavlja jednostavnom objašnjenju da je metilensko plavilo antioksidans. Kod tretiranih miševa zabeleženo je pojačano stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika u moždanim mitohondrijama, konkretno vodonik-peroksida. Pretpostavka autora glasi: blag peroksidni signal aktivira put Nrf2, koji zatim pokreće program biogeneze. U ovom modelu metilensko plavilo deluje kao prooksidans u fazi okidanja, a kao antioksidans u fazi ishoda. Taj obrazac farmakolozi nazivaju hormezom, pri kojoj mali stres izaziva odbrambeni odgovor veći od samog stresa. Nije direktno ispitano da li porast peroksida zaista izaziva aktivaciju Nrf2; to je pretpostavljena veza, a ne izmerena karika.

Prateća studija iste grupe podvrgla je bezbednosni aspekt te pretpostavke dodatnoj proveri. U izolovanim moždanim mitohondrijama metilensko plavilo povećavalo je proizvodnju vodonik-peroksida već pri koncentracijama od 50 nanomola po litru, ali terapijske koncentracije nisu izazvale uočljivo oštećenje mitohondrijske DNK. Tek pri 100 mikromola po litru, daleko iznad terapijskih nivoa, odabrani fragmenti mtDNK pokazali su oštećenje, a kombinacija boje u koncentraciji od 20 mikromola po litru i crvene svetlosti proizvela je singletni kiseonik koji je oštetio mtDNK u širokom obimu. To odgovara poznatom fotosenzibilizujućem delovanju ove boje, a ne njenom farmakološkom delovanju u mraku. Prethodni tretman čak je zaštitio mitohondrije ventralnog dela srednjeg mozga od lezija mtDNK izazvanih rotenonom. Odgovor u zavisnosti od doze i kontrolni eksperimenti za genotoksičnost detaljno su opisani u studiji o negenotoksičnom stvaranju peroksida pod dejstvom metilenskog plavila.

Izmereno naspram pretpostavljenog: čitanje dijagrama

Dijagram puta u nastavku izrađen je za ovaj članak kako bi jasno istakao razliku na kojoj tekst insistira. Okviri sa punim linijama predstavljaju korake za koje postoje neposredni eksperimentalni dokazi u literaturi o metilenskom plavilu: redoks ciklus koji menja NAD/NADH, prolaznu fosforilaciju AMPK, indukciju PGC-1alpha i SURF1, veću aktivnost kompleksa IV, indukciju NQO1 i TrxR1, obnovljenu ekspresiju gena biogeneze i broj kopija mtDNK u mozgu miša, kao i porast peroksida bez oštećenja mtDNK pri terapijskim dozama. Okviri sa isprekidanim linijama predstavljaju pretpostavljene veze: Keap1 registruje peroksidni signal, nakupljanje Nrf2 u jedru pokreće odbrambene gene, a uzročna strelica povezuje aktivaciju Nrf2 sa programom biogeneze. Ti isprekidani koraci su verovatni, u skladu su sa podacima i pripadaju standardnoj udžbeničkoj biologiji, ali u ovim radovima nisu mereni uz kontrolne provere (Nrf2 u jedru, ARE reporteri, isključivanje gena Nrf2) koje bi opravdale njihovo prikazivanje punim linijama.

Kada je dijagram pred vama, tri zabune postaju očigledne. Prvo, NRF1 i Nrf2 su različiti proteini sa gotovo identičnim nazivima; studija na miševima merila je nuklearni respiratorni faktor 1, regulator biogeneze, a ne antioksidativni transkripcioni faktor, i njihovo poistovećivanje svodi ceo dijagram na jedan čvor. Drugo, ekspresija gena je početak priče, a ne kraj; obnovljeni nivoi informacione RNK za TFAM ili COX1 podržavaju zaključak da je biogeneza zatražena, dok su broj kopija mtDNK i aktivnost kompleksa IV dokazi da je zahtev ispunjen. Treće, antioksidativni ishod ne dokazuje put preko Nrf2; pad nivoa oksidansa od 28 procenata u fibroblastima i zaštita od rotenona kod miševa stvarni su nizvodni efekti, ali do njih vodi više različitih puteva.

Šta bi isprekidani okvir pretvorilo u puni

Eksperimenti koji nedostaju su standardni. Merenje proteina Nrf2 u jedru nakon izlaganja metilenskom plavilu, uz vremensko praćenje usklađeno sa prolaznim signalom AMPK, proverilo bi da li se obe grane zaista aktiviraju zajedno, kako tvrdi hipoteza sinhronizovane aktivacije. Reporter kojim upravlja ARE potvrdio bi transkripcionu aktivnost, umesto da se o njoj zaključuje na osnovu ciljnih gena. Ponavljanje merenja pokazatelja biogeneze uz smanjenu ekspresiju ili isključen gen Nrf2 direktno bi proverilo uzročnu strelicu: ako se indukcija kompleksa IV i povećanje količine mtDNK održe bez Nrf2, pretpostavljena veza je pogrešna i grana AMPK sama nosi taj efekat. U istraživanjima na životinjama, studija hroničnog davanja sa iste tri kontrolne tačke, regulatorom, sadržajem i funkcijom, proverila bi da li program ostaje uključen ili se prilagođava. Do tada, sinhronizovana aktivacija energetskih i odbrambenih puteva ostaje ono kako su je njeni autori opisali: mogući ključni faktor, a ne utvrđeni mehanizam.

Čitaocima koji ovoj temi pristupaju iz šire farmakološke perspektive može biti potreban okolni kontekst: kako metilensko plavilo prenosi elektrone na mitohondrijskom nivou, kako još utiče na mitohondrije i ćelijsku energiju, gde se nalazi o senescenciji uklapaju u istraživanja starenja, kako se tvrdnje o biogenezi odnose na kognitivne sposobnosti i kakvi podaci o bezbednosti postavljaju granice svakoj raspravi o doziranju. Svaki od tih koncepata je zaseban i ima sopstvene dokaze, i svaki zaslužuje isto razdvajanje izmerenog od pretpostavljenog koje je ovaj članak primenio na Nrf2.