Članak
Metilensko plavilo i autofagija: AMPK, mTOR i eksperimenti na neuronskim ćelijama
Zamislite da izvodite eksperiment na ćelijama, dodate metilensko plavilo i vidite da proteinska traka označena kao LC3-II na vašem imunoblotu postaje tamnija. Primamljivo je objaviti da jedinjenje „pojačava autofagiju” i nastaviti dalje. Takvo tumačenje je preuranjeno. Tamnija traka LC3-II može značiti da ćelija stvara više vezikula za uklanjanje otpada, ali može značiti i da se vezikule gomilaju jer je korak razgradnje blokiran. Ova dva tumačenja ukazuju na suprotne smerove, a literatura o metilenskom plavilu u neuronskim ćelijama sadrži primere dokaza obe vrste. Ovaj članak razmatra šta je zaista izmereno, analizu po analizu.
Makroautofagija, oblik koji se ovde proučava, predstavlja sistem masovne reciklaže u ćeliji. Membranska vrećica zvana fagofora raste oko istrošenih proteina i organela, zatvara se u autofagozom, spaja se sa lizozomom, a njen sadržaj se razgrađuje i oslobađa za ponovnu upotrebu. Neuroni zavise od ovog procesa jer se ne dele i ne mogu da razrede oštećene delove ćelijskom deobom. Kada reciklaža zastane, otpad se nakuplja. Kada funkcioniše, ćelija pod stresom ponovo dobija gradivne komponente.
Šta je pokazao jedan eksperiment na hipokampalnim ćelijama
Glavna studija indukcije koristila je mišje hipokampalne ćelije HT22 izložene stresu uskraćivanjem seruma tokom 24 sata, uslovom koji uklanja faktore rasta i trofičke signale i pokreće i apoptozu i autofagiju. Istraživači su naveli da je metilensko plavilo smanjilo ćelijsku smrt na način zavisan od doze i da su ovu zaštitu pratili znaci makroautofagije.
Promene markera bile su specifične. Difuzno bojenje LC3B preraspodelilo se u perinuklearne tačkaste strukture počev od približno 20 nM metilenskog plavila, uz najizraženiji odgovor LC3-I i LC3-II oko 1 μM. I LC3B-I i LC3B-II povećavali su se u zavisnosti od doze i vremena. Važno je da je tim otišao korak dalje od statičkog imunoblota LC3. Dodali su 10 μM hlorokina, koji blokira lizozomsko uklanjanje, i ustanovili više LC3-II uz stabilizovan p62 u ćelijama tretiranim metilenskim plavilom. Taj obrazac podržava obrt zavisan od lizozoma, a ne puko nagomilavanje. Takođe su pokazali da je hlorokin delimično poništio antiapoptotski efekat, što u ovom modelu povezuje zaštitu sa putem autofagije i lizozoma.
Rezultat vezan za signalizaciju najčešće se pogrešno prenosi. Signalizacija AMPK, procenjena preko fosforilisanog AMPK i njegove nizvodne mete, fosforilisanog ACC, povećala se nakon 12 i 24 sata u zavisnosti od doze. Inhibitor AMPK Compound C, primenjen u koncentraciji od 20 μM tokom poslednja 4 sata, smanjio je i fosforilaciju ACC i aktivaciju LC3. Nasuprot tome, fosforilisani mTOR nije pokazao uočljivu supresiju. Dakle, u hipokampalnim ćelijama pod stresom nalaz je bio indukcija povezana sa AMPK putem koji je, po svemu sudeći, nezavisan od mTOR. Isti obrazac pojavio se kod živih miševa, kod kojih je tretman metilenskim plavilom indukovao markere makroautofagije u korteksu i hipokampusu.
Indukcija nije završen autofagijski tok
Ovde je razlika između pojmova najvažnija. Indukcija znači da uzvodni mehanizmi stvaraju više autofagozoma. Autofagijski tok znači da sadržaj prolazi čitav put: izdvajanje, sazrevanje, spajanje sa lizozomom, razgradnju i reciklažu. Svako povećanje LC3-II predstavlja tvrdnju o indukciji dok test autofagijskog toka ne potvrdi ostatak puta.
Standardni test autofagijskog toka meri LC3-II sa kratkotrajnom lizozomskom blokadom, poput bafilomicina A1 ili hlorokina, i bez nje. Ako tretman zaista ubrzava stvaranje, blokiranje razgradnje trebalo bi dodatno da poveća LC3-II. Tandemski reporter mCherry-GFP-LC3 pruža drugi ugao posmatranja: strukture svetle žuto pre spajanja sa lizozomom, a samo crveno nakon što kisela sredina ugasi signal GFP, pa veći broj isključivo crvenih tačkastih struktura podržava napredovanje u kisele autolizozome. Smanjenje nivoa proteina p62 može potkrepiti obrt sadržaja, uz napomenu da i sama transkripcija p62 reaguje na stres i da je treba proveriti na nivou mRNA.
Kontrolna lista u nastavku povezuje svaku analizu korišćenu u ovoj literaturi sa onim što meri i onim što sama ne može da dokaže. Čitaoci je mogu primeniti na bilo koju buduću tvrdnju o makroautofagiji, uključujući argumente o postu i dugovečnosti koji se oslanjaju na ove markere.
| Analiza | Šta meri | Šta sama ne može da dokaže |
|---|---|---|
| Nivo LC3B-I | Veličinu citosolskog skupa prekursora dostupnih za lipidaciju | Aktivnost autofagije; sinteza i obrada takođe menjaju ovaj nivo |
| Nivo LC3B-II | Količinu LC3 vezanog za membrane na autofagijskim strukturama | Završen autofagijski tok; porast može značiti brže stvaranje ili blokirano uklanjanje |
| Tačkaste strukture LC3 i perinuklearna agregacija | Preraspodelu LC3 u vezikularne strukture | Smer promene; statične slike ne mogu razlikovati ubrzanje od zastoja |
| LC3-II uz hlorokin ili bafilomicin A1 i bez njih | Da li novi autofagozomi nastavljaju da se stvaraju kada je uklanjanje blokirano | Potpunu razgradnju sadržaja; potrebna je kratka, optimizovana izloženost inhibitoru |
| Nivo proteina p62 | Obrt adaptora za sadržaj koji se obično razgrađuje u autolizozomima | Isključivo autofagijski tok; putevi odgovora na stres takođe regulišu transkripciju p62 |
| Tandemski reporter mCherry-GFP-LC3 | Napredovanje u kisele autolizozome (prelazak sa žutog na isključivo crveni signal) | Potpunu razgradnju svake vrste sadržaja |
| Fosforilisani AMPK i fosforilisani ACC | Angažovanje senzora energetskog stresa i njegov signalni odgovor | Da je autofagija uzrokovala efekat na preživljavanje; AMPK kontroliše brojne metaboličke grane |
| Fosforilisani mTOR, p70S6K, 4EBP1 | Aktivnost signalnog puta rasta koji ograničava autofagiju | Autofagijski tok; ovo su uzvodni signali koji omogućavaju proces, a ne pokazatelji razgradnje |
Obratite pažnju na jednu terminološku zamku od koje tabela štiti. Fosforilisani ACC je enzimski inhibiran oblik. Njegov porast pokazuje signalni odgovor AMPK, a ne aktivaciju ACC.
Izraz „inhibicija makroautofagije ukinula je neuroprotekciju” zahteva istu preciznost. U modelu HT22 to znači da je ometanje puta autofagije i lizozoma uklonilo prednost u preživljavanju koju je metilensko plavilo pružalo pri uskraćivanju seruma. To podržava zaključak da je autofagija neophodna ili da doprinosi efektu u toj ćelijskoj kulturi. Ne potvrđuje da je autofagija jedini zaštitni mehanizam jedinjenja, ne dokazuje da hlorokin deluje isključivo preko autofagije, a za snažniju tvrdnju o uzročnosti bilo bi potrebno genetički izmeniti funkciju ATG5, ATG7 ili ULK1.
Dva puta do istog mehanizma
Pojednostavljena mapa pomaže. Energetski stres povećava aktivnost AMPK, AMPK aktivira kompleks ULK1 i autofagija počinje. Faktori rasta i hranljive materije povećavaju aktivnost mTORC1, mTORC1 inhibira ULK1 i autofagija ostaje neaktivna. Nizvodno od ULK1, kompleks Beclin-1 i VPS34 započinje formiranje fagofore, LC3-I se lipidacijom pretvara u LC3-II, autofagozom se zatvara, spaja sa lizozomom i sadržaj se razgrađuje uz obrt p62.
Dijagram smešta svaki nalaz o metilenskom plavilu na ovu mapu: hipokampalni rezultat uz granu AMPK, a rezultat na progenitorskim ćelijama uz granu mTOR.
Ovakav okvir razrešava prividnu nesaglasnost sa drugom studijom grupe Xie. U proliferativnim neuralnim progenitorskim ćelijama pacova, zaseban eksperiment pokazao je da je 5 μM metilenskog plavila inhibiralo proliferaciju i podstaklo mirovanje, uz smanjenje broja Ki67 pozitivnih ćelija 1. i 3. dana, dok je diferencijacija ka neuronskoj liniji ostala očuvana. Tu je mehanizam delovao preko potisnute signalizacije mTOR: smanjenog ukupnog mTOR i fosforilisanog mTOR, uz nižu ekspresiju p70S6K i 4EBP1, kao i smanjenu ekspresiju ciklina E1, B1, D1 i D2. Dominantni fenotip bilo je mirovanje progenitorskih ćelija, koje su autori povezali sa odloženom senescencijom, a ne sa spasavanjem hipokampalnih ćelija pod stresom.
Između ova dva rada nema protivrečnosti. AMPK i mTOR su integratori osetljivi na kontekst, a ne fiksni prekidači. Ćelija nalik neuronu koja je pod stresom može angažovati AMPK bez merljive inhibicije mTOR, dok progenitorska ćelija podstaknuta mitogenima može odgovoriti na isto jedinjenje usporavanjem mehanizama rasta zavisnih od mTOR. Tip ćelije, kontekst stresa, koncentracija i vremenska tačka određuju koja grana dominira. Zato mitohondrijski energetski i redoks efekti metilenskog plavila pripadaju istoj slici: kako opisuje pregled mehanizama neuroprotekcije, jedinjenje deluje kao alternativni prenosilac elektrona, angažuje antioksidativnu i antiapoptotsku signalizaciju, inhibira MAO i NOS i povezano je sa obnovom mitohondrija preko biogeneze i autofagije. Autofagija je jedna grana pleiotropnog profila, a ne cela priča.
Šta eksperimenti ne pokazuju
Uskraćivanje seruma modeluje trofički i metabolički stres u ćelijskoj kulturi. Ono ne modeluje post celog organizma: glukoza, aminokiseline i soli ostaju u osnovnom medijumu, a ponašanje vezano za uzimanje hrane ne postoji. Koncentracije u kulturi od 20 nM do 5 μM ne mogu se aritmetički pretvoriti u doze za ljude, jer se apsorpcija, vezivanje za proteine, redoks stanje, metabolizam, nakupljanje u tkivima i vreme izloženosti razlikuju.
Nijedno ispitivanje na ljudima nije osmišljeno da pokaže autofagijski tok izazvan metilenskim plavilom kod pacijenata. Mehanistički dokazi i dalje potiču iz ćelijskih, ex vivo i životinjskih istraživanja, a pregledni radovi i dalje opisuju dokaze za prenošenje ovih nalaza u kliničku praksu kao preliminarne. Zato ove studije ne pokazuju da metilensko plavilo oponaša post, produžava ljudski životni vek putem autofagije ili dovodi autofagijski tok do kraja u ljudskom mozgu. Tvrdnje o oponašanju posta i dugovečnosti zahtevaju sopstvene kliničke dokaze, a ispitivanja metilenskog plavila kod ljudi za druge indikacije ne postaju ispitivanja autofagije samo zbog povezanosti. Istraživanja modela stresa izazvanog manjkom hranljivih materija i modela dugovečnosti treba čitati uz poštovanje te granice.
Na sledeći rad koji budete čitali primenite kontrolnu listu redom. Najpre pitajte koja se grana promenila: AMPK, mTOR ili nijedna. Zatim pitajte da li je rezultat za LC3 praćen testom autofagijskog toka ili stoji samostalno. Potom proverite da li je blokiranje puta uklonilo korist i kojom metodom. Studija koja odgovori na sva tri pitanja opravdava snažnu mehanističku tvrdnju. Ona koja odgovori samo na prvo pokazala je signal koji omogućava proces, dok ostatak puta ostaje nemapiran.