Merenje reaktivnih vrsta kiseonika u eksperimentima sa metilenskim plavim

Dve laboratorije sprovode ono što svaka naziva eksperimentom o antioksidativnom delovanju metilenskog plavog. Jedna izveštava da boja suzbija reaktivne vrste kiseonika. Druga izveštava da ih stvara. Obe prikazuju jasne krive zavisnosti odgovora od doze. Obe su iskrene. Razlika nije u prevari ili nestručnosti. Razlog je to što su dve grupe merile različite pojave pod različitim osvetljenjem, pomoću sondi koje odgovaraju na različita pitanja, a zatim oba odgovora opisale istom rečju: ROS.

Metilensko plavo je molekul koji je teško precizno meriti upravo zato što učestvuje u hemijskim reakcijama koje bi trebalo da posmatra. U mraku prenosi elektrone između donora i akceptora i vraća se u početni oblik, spremno za novi ciklus. Pod svetlošću postaje fotosenzibilizator, dostižući pobuđeno tripletno stanje iz kojeg može preneti energiju kiseoniku i stvoriti singletni kiseonik ili preneti elektrone i stvoriti radikale i vodonik-peroksid. Svaku sondu uvedenu u taj sistem sama boja može oksidovati, redukovati, izbeliti ili optički zakloniti. Zato prvo pitanje pri bilo kom očitavanju ROS nikada nije kolika je izmerena vrednost. Pitanje je šta test zapravo detektuje i kako boja utiče na test.

Amplex Red: kalibrisan test za vodonik-peroksid

Kombinacija metilenskog plavog i Amplex Red predstavlja spoj koji se u ovoj literaturi može najbolje opravdati, kada je pravilno postavljen. Hemija je specifična: peroksidaza iz rena koristi vodonik-peroksid da oksiduje supstrat Amplex u fluorescentni proizvod, resorufin, uz približno stehiometrijski odnos jedan prema jedan. Peroksid iz uzorka postaje fluorescencija koju registruje detektor. Nijedna druga uobičajena reaktivna vrsta kiseonika ne pokreće tu reakciju direktno.

Presudna prednost je kalibracija. Pažljiv istraživač meri standarde sa poznatom količinom peroksida u istom puferu, sa istim koncentracijama peroksidaze i supstrata, istim vremenom inkubacije i istim optičkim podešavanjima, a zatim očitava uzorke prema toj krivoj. U studiji izolovanih mitohondrija mozga na kojoj se ova metoda zasniva, autori su uradili upravo to: dodavali su poznate količine peroksida na kraju svakog merenja, a rezultate su prikazali kao brzine u pikomolima po minutu po miligramu proteina, umesto u proizvoljnim jedinicama fluorescencije. Upravo to pretvara svetlucanje u merenje.

Tri detalja iz te studije zaslužuju da se primene i drugde. Prvo, autori su proverili signal pomoću katalaze, koja razgrađuje peroksid. Porast fluorescencije izazvan metilenskim plavim prestao je nakon dodavanja katalaze, potvrđujući da signal potiče od peroksida, a ne od optičkog artefakta. Drugo, direktno su ispitali uticaj osvetljavanja tako što su zatvaračem ograničili ekscitacioni snop, pa su uzorci primili jednu osminu uobičajene doze svetlosti, a signal je opao za samo devet procenata. Više od devedeset procenata peroksida koji su prijavili bilo je nezavisno od svetlosti korišćene pri merenju. Treće, zasebno su merili uklanjanje peroksida pomoću elektrode i utvrdili da boja istovremeno povećava njegovu proizvodnju i usporava uklanjanje. Sonda koja prikazuje samo neto fluorescenciju spojila bi ta dva efekta u jedan.

Test ipak ima načine na koje može dati pogrešan rezultat, a metilensko plavo izaziva nekoliko njih. Boja apsorbuje svetlost u širokom delu istog crvenog područja u kojem resorufin emituje, pa pri visokim koncentracijama boje uzorak može zakloniti sopstveni signal zbog efekata unutrašnjeg filtera. Standardi zato treba da sadrže istu koncentraciju boje kao uzorci. Amplex Red može i sam da podleže fotooksidaciji, a njegov proizvod resorufin može ući u fotoredoks ciklus koji stvara superoksid i peroksid, što je naročito važno kada se u eksperimentu osvetljava i fotosenzibilizator. Praktično rešenje je da se uzorci sa metilenskim plavim prvo ozrače, a zatim da se alikvoti ispituju Amplex reagensima u mraku, umesto da se boja i sonda osvetljavaju zajedno. Konačno, superoksid-dismutaza ne smanjuje nužno Amplex signal: pretvaranje superoksida u peroksid može ga povećati. Kontrola sa SOD koja povećava fluorescenciju nije neuspešna. Ona je prepoznala superoksid kao vrstu koja prethodi peroksidu u reakcionom putu.

DCFDA: nespecifični pokazatelj oksidacije

Kombinacija metilenskog plavog i DCFDA izvor je najvećeg dela zabune. DCFH-DA je prekursor koji se unosi u ćelije. Esteraze unutar ćelije uklanjaju njegove acetatne grupe, ostavljajući nefluorescentni DCFH, čijom oksidacijom nastaje fluorescentni DCF. Spisak onoga što ga oksiduje je dug: hidroksilni radikali, međuproizvodi peroksidaze i hema, azot-dioksid, hipohlorasta kiselina i radikali nastali iz peroksinitrita. Sam vodonik-peroksid ga ne oksiduje direktno brzinom korisnom za merenje; fluorescencija zavisna od peroksida uglavnom zahteva učešće gvožđa, hemoproteina ili reakcija peroksidaze.

Kritička analiza koju bi trebalo citirati u svakom odeljku o metodama potiče iz ispitivanja DCFH kao sonde koje su sproveli Kalyanaraman i saradnici, sažetog u studiji mitohondrija mozga koja je iz tog razloga odbacila DCFDA. Pokazali su da sonda reaguje sporo, uz neodređenu stehiometriju, bez valjane kalibracije i sa jedinjenjima koja nisu ROS. Sonda takođe pojačava ono što meri: jednoelektronska oksidacija DCFH stvara DCF radikal koji reaguje sa kiseonikom i stvara superoksid, a on dismutacijom daje dodatni peroksid. Očitavanje delimično samo stvara hemijske reakcije o kojima izveštava.

Ništa od ovoga ne čini DCFDA beskorisnim. To ga čini testom za preliminarnu procenu, a ne za identifikaciju. Porast fluorescencije DCF znači da se povećala oksidacija sonde zavisna od oksidanasa. To ne znači da se povećala količina peroksida, a svakako ne znači da se povećala ukupna količina ROS, koju nijedna pojedinačna sonda ne meri. Ranija istraživanja metilenskog plavog koja su se oslanjala na oksidaciju DCF pri koncentracijama iznad jednog mikromolara izveštavala su o prooksidativnim efektima, dok su drugi sistemi iz istog perioda pokazivali zaštitu od ćelijske smrti izazvane peroksidom. Oba zapažanja mogu važiti za istu boju u različitim redoks uslovima, a sam rezultat DCF ne može pokazati koji je oksidans nosio signal. Značaj ranijeg istraživanja mitohondrija mozga jeste u tome što je ovu preliminarnu procenu zamenilo kalibrisanim merenjem peroksida i direktno utvrdilo opterećenje: čak je i sto nanomolara boje višestruko povećalo oslobađanje peroksida pri svakom ispitanom supstratu i respiratornom stanju.

DCFDA ima još jednu zamku specifičnu za metilensko plavo. Boja je intenzivno obojena i redoks aktivna, pa može izbledeti fluorescenciju, prigušiti emisiju ili oksidovati sondu nezavisno od ćelijskih ROS. Kontrola bez ćelija, sa bojom i sondom, nije neobavezan dodatak. To je eksperiment koji pokazuje da li boja reaguje sa sondom.

Hvatanje radikala spinskim zamkama i potrošnja kiseonika: identitet i tok

Dok fluorescentne sonde pokazuju da se pojavilo nešto podložno oksidaciji, elektronska spinska rezonanca sa spinskim zamkama daje odgovor bliži tome šta je to bilo. Klasična studija fotohemije metilenskog plavog koristila je ESR za detekciju askorbatnog radikala nastalog uz boju, askorbat i svetlost, a zatim je pokazala nastajanje peroksida u eksperimentima merenja potrošnje kiseonika i nastajanje hidroksilnih radikala katalizovano gvožđem u eksperimentima sa spinskim zamkama. Svaka tehnika odgovorila je na pitanje na koje druge nisu mogle: ESR je dao identitet radikala, potrošnja kiseonika dala je reakcioni tok nezavisan od bilo koje fluorescentne sonde, a njihova kombinacija pokazala je da u istom osvetljenom sistemu deluju i putevi singletnog kiseonika i radikalski putevi.

Taj rezultat iz 1984. i dalje zvuči kao upozorenje. Uz osvetljavanje i prisustvo redukcionog sredstva, boja je stvarala peroksid, a uz prisustvo gvožđa sistem je stvarao hidroksilni radikal, najreaktivniju vrstu u toj grupi. Autori su to povezali sa askorbatom u oku i doveli u pitanje olaku oftalmološku upotrebu. Današnji čitaoci treba da obrate pažnju na uslove: svetlost plus redukciono sredstvo plus gvožđe. Uklanjanjem bilo kog od njih put slabi ili nestaje.

Kiseonične elektrode opravdavaju svoju ulogu na drugačiji način. Elektroda Clarkovog tipa meri neto potrošnju kiseonika, čime utvrđuje da redoks reakcije koje pokreće boja troše molekularni kiseonik i daje kinetičke podatke koje nijedan artefakt fluorescencije ne može oponašati. Ona ne identifikuje proizvod. Nastajanje peroksida, superoksida i vode, kao i procesi deaktivacije singletnog kiseonika, troše kiseonik. Tok bez identiteta nepotpun je isto koliko i identitet bez toka, zbog čega kvalitetni radovi kombinuju elektrodu sa kalibrisanim testom za peroksid ili sa zamkom.

Zašto su rezultati o antioksidativnom delovanju protivrečni

Kada se ova tri očitavanja uporede jedno pored drugog, prividne protivrečnosti u literaturi o metilenskom plavom svode se na razlike u metodama i tri biološke činjenice.

Prvo, boja je istovremeno prenosilac elektrona i izvor peroksida. Preusmeravanjem elektrona sa mesta u respiratornom lancu na kojima bi kiseonik inače postao superoksid, ona može smanjiti jednu vrstu ROS, dok njen redukovani oblik direktno redukuje kiseonik u peroksid i povećava drugu. Laboratorija koja se bavi mitohondrijskom redoks hemijom i ulogom boje u zaobilaženju delova respiratornog lanca zato treba da očekuje odgovore zavisne od sonde: očitavanje osetljivo na superoksid opada, dok očitavanje peroksida raste u istoj kiveti.

Drugo, peroksid u malim dozama predstavlja signal, a ne samo oštećenje. Studija mitohondrija mišjeg mozga koja je usledila nakon ranijeg istraživanja utvrdila je stvaranje peroksida već pri pedeset nanomolara boje, bez oštećenja mitohondrijske DNK pri terapijskim nivoima, uz zaštitu od oštećenja izazvanih rotenonom nakon pretretmana. Tek pri sto mikromolara, daleko iznad terapijskog opsega, boja je oštetila odabrane fragmente DNK, a crvena svetlost uz dvadeset mikromolara boje stvorila je singletni kiseonik koji je oštetio sve ispitane fragmente. Predloženi mehanizam je hormetički: blago stvaranje peroksida pokreće antioksidativnu odbranu povezanu sa Nrf2 i mitohondrijsku biogenezu, pa kratkoročno prooksidativno očitavanje prethodi dugoročnijem antioksidativnom ishodu. Test očitan nakon jednog sata i test očitan nakon jednog dana mogu dati različite rezultate zato što se biologija u međuvremenu promenila.

Treće, svetlost određuje čak i koji je molekul prisutan. Osvetljavanje demetiluje boju, dovodeći do nastanka Azure B i srodnih proizvoda, a svetlost mikroskopske lampe iznad posude dovoljna je da izazove njeno fotosenzibilizujuće delovanje. Eksperimenti u mraku i osvetljeni eksperimenti različiti su eksperimenti, pa odeljak o kontrolama osvetljavanja i rukovanju bojom u svakom protokolu treba tako i da ih tretira.

Minimalni skup kontrola i kako tumačiti bilo koju tvrdnju

Poređenje u nastavku predstavlja originalni referentni materijal za ovaj članak. Pre nego što prihvatite bilo koji rezultat o ROS uz metilensko plavo, proverite koji su red autori popunili, a koji preskočili.

Iz ovoga sledi praktično pravilo za tumačenje. Kalibrisan Amplex sa peroksidazom i proverom pomoću katalaze pruža dokaz o peroksidu. DCFDA pruža dokaz o nespecifičnoj oksidaciji sonde i ničemu više. Hvatanje radikala spinskim zamkama, uz kontrole sa hvatačima radikala, pruža dokaz o identitetu radikala. Potrošnja kiseonika pruža dokaz o toku. Rečenica koja tvrdi više nego što njen test može da potkrepi, koliko god samouvereno bila napisana, govori o sondi, a ne o boji. Povezane rasprave o zavisnosti od doze i hormetičkom opsegu, mitohondrijskom toku elektrona, ometanju testova u obojenim uzorcima i artefaktima osvetljavanja pri mikroskopiranju proširuju svaku od ovih tačaka, a svaka ostaje važeća i nakon što se njena privremena referenca zameni.