Objašnjenje Loefflerovog alkalnog i polihromnog metilenskog plavog za bojenje

Na laboratorijskom stolu za bojenje mogu stajati tri boce jedna pored druge, svaka označena kao neka varijanta metilenskog plavog. Na jednoj piše vodeno metilensko plavo 1%. Na drugoj Loefflerovo alkalno metilensko plavo. Na trećoj polihromno metilensko plavo. Zauzet radnik poseže za najbližom. Razmaz se zatim oboji preslabo, suviše ujednačeno plavo ili u neočekivanim nijansama ljubičaste, a za rezultat se okrivi uzorak.

To je problem formulacije, a ne uzorka. Tri rastvora sadrže srodne boje, ali zasnivaju se na različitim konceptima bojenja. Jedan je obična katjonska boja pri gotovo neutralnom pH. Drugi je ista boja čije je delovanje pojačano alkalijom. Treći više uopšte nije jedna boja, već namerno oksidovana smeša. Ako upotrebite pogrešan rastvor, menja se i princip bojenja.

Kratak odgovor

Obično vodeno metilensko plavo je polazna osnova: oko 1% boje u vodi, jednostavno katjonsko sredstvo za bojenje namenjeno posmatranju morfologije bakterija i opštoj mikroskopiji. Kod Loefflerovog alkalnog metilenskog plavog, alkoholnom matičnom rastvoru razblaženom vodom dodaje se mala, odmerena količina razblažene alkalije, čime se povećava pH i pojačava vezivanje katjonske boje za kisele strukture bakterija. Polihromno metilensko plavo je metilensko plavo koje je namerno sazrevalo oksidacijom u alkalnoj sredini, pa boca sadrži smešu demetilovanih homologa (azure A, azure B, azure C), tionina i metilenskog ljubičastog, uz preostalo metilensko plavo. Ta smeša boji različite strukture različitim nijansama.

Ako zapamtite samo jednu rečenicu: alkalizacija menja intenzitet bojenja, dok polihromiranje menja boje koje se dobijaju bojenjem.

Obično vodeno metilensko plavo: referentna tačka

Najjednostavnija formulacija je metilensko plavo rastvoreno u vodi, obično u koncentraciji od 1% w/v, bez alkalije i bez oksidacije. Obojena hemijska vrsta je metiltioninijumski katjon sa hloridnim protivjonom, mala, planarna fenotiazinska boja koja je u PubChem zapisu o metilenskom plavom opisana kao metiltioninijum-hlorid. Kao katjon, vezuje se za fosfatni skelet nukleinskih kiselina i kisele grupe na ćelijskim zidovima bakterija, bojeći ćelije plavo na svetloj pozadini.

Njegova prednost je predvidljivost. Jedra i bakterije izgledaju plavo. Kontrast je umeren. Slabo vidljivi organizmi mogu se slabo obojiti, što je upravo ograničenje koje je Loeffler nastojao da otkloni. Za širu grupu jednostavnih sredstava za bojenje bakterija kojoj ovaj rastvor pripada, pogledajte pregled jednostavnog bojenja bakterija. I ovde je važno precizno utvrditi identitet: metil plavo je potpuno drugačiji molekul, kao što objašnjava članak metil plavo naspram metilenskog plavog, pa pretraga kataloga samo prema nazivu boje može dovesti do pogrešne klase boja.

Loefflerovo alkalno metilensko plavo: ista boja, snažnije delovanje

Klasična Loefflerova receptura kombinuje alkoholni matični rastvor metilenskog plavog sa razblaženom alkalijom u vodi. Udžbeničke verzije navode 0.3 g boje u 30 mL 95% etanola, uz 100 mL 0.01% vodenog rastvora kalijum-hidroksida (ili ekvivalentno 30 mL zasićenog alkoholnog rastvora metilenskog plavog, 100 mL destilovane vode i 1 mL 1% KOH), čime se dobija radni rastvor sa oko 0.3% boje i izrazito alkalnim pH. Komercijalne verzije slede isti princip, a Thermo Fisher katalog mikrobioloških sredstava za bojenje navodi Loefflerovo alkalno metilensko plavo, polihromnu i vodenu varijantu kao zasebne kataloške artikle sa različitim namenama.

Ključ je u alkaliji. Povećanje pH deprotonuje karboksilne i fosfatne grupe u uzorku, povećavajući gustinu negativno naelektrisanih mesta, dok alkoholni matični rastvor održava boju potpuno rastvorenom, tako da ona do tih mesta stiže u monomernom obliku. Rezultat je brže i intenzivnije bojenje bakterija nego sa neutralnom vodenom bojom, uz prepoznatljive tamnoplave štapiće i koke u rutinskom bakteriološkom razmazu. Bojenje obično traje jedan do tri minuta, nakon čega sledi ispiranje vodom.

Klasična primena je bojenje Corynebacterium diphtheriae uzgajane na Loefflerovoj serumskoj podlozi: tankih, često toljagastih štapića sa intenzivno obojenim metahromatskim Babes-Ernstovim granulama uskladištenog polifosfata. Veza između podloge i sredstva za bojenje je istorijska, jer se oba pripisuju istom bakteriologu, a kontrast granula predstavlja dijagnostičku prednost. Osim u radu sa difterijom, ovo sredstvo služi za opšte bakteriološko bojenje razmaza iz kultura, za prikaz morfologije Neisseria u kliničkim razmazima i svuda gde bojenje po Gramu nije potrebno, ali obično vodeno plavo daje preslab rezultat. To je monohromno sredstvo za bojenje. Sve što je kiselo poprima neku nijansu plave. Kada protokol zahteva razlikovanje pomoću boje, sama alkalija to ne može da obezbedi.

Jedna praktična napomena: alkalni rastvori boja propadaju i stvaraju talog tokom čuvanja i usled apsorpcije ugljen-dioksida. Laboratorije zato pripremaju manje količine ili kupuju kataloški rastvor i poštuju njegov rok upotrebe, umesto da nastavljaju da koriste staru bocu iz koje se sada talog prenosi na svako predmetno staklo.

Polihromno metilensko plavo: jedan naziv, više boja

Polihromno metilensko plavo polazi od iste boje, ali je podvrgava kontrolisanoj oksidaciji u alkalnoj sredini, istorijski nazivanoj sazrevanjem ili polihromiranjem. Starenje u alkalnoj sredini, zagrevanje sa karbonatom ili oksidacija sredstvima poput dihromata postepeno uklanjaju metil-grupe sa dimetilamino supstituenata. Proizvod je smeša: preostalo metilensko plavo, azure B (izgubljena jedna metil-grupa), azure A i azure C (dalja demetilacija), tionin (potpuno demetilovan) i sporedni proizvodi oksidacije iz porodice metilenskog ljubičastog. Svaka komponenta ima svoju nijansu i afinitet prema tkivu, pa smeša boji metahromatski: jedra, granule, mucini i hrskavica poprimaju različite tonove, od plave do crvenoljubičaste.

Ista hemija stoji iza poznatih sredstava za bojenje krvi. Rani istraživači otkrili su da alkalizovano metilensko plavo boji jedra parazita malarije u nijanse ljubičaste, ali njihovi vodeni rastvori dobijeni sazrevanjem bili su nestabilni i stvarali su talog za nekoliko dana. Pregled kako je izumljeno ljubičasto sredstvo za bojenje krvi opisuje kako su Malachowski i Romanowsky nezavisno iskoristili ovaj efekat 1891, kako je uveden metanol radi stabilizacije taloga boje i fiksiranja razmaza bez zagrevanja i kako je Giemsa kasnije standardizovao smešu sa odmerenom količinom azure B i eozina, uz stabilizaciju glicerolom. Savremena sredstva za bojenje tipa Giemsa direktno potiču od polihromnog metilenskog plavog sa eozinom, kombinacije koja stvara Romanowsky efekat. Za detalje o kombinovanju sa eozinom i komponenti azure B pogledajte sredstva za bojenje tipa Romanowsky i interakciju azure B sa eozinom.

Pošto je smeša, polihromno metilensko plavo je po svojoj prirodi najmanje standardizovano od ova tri sredstva. Tačan odnos nijansi zavisi od postupka i stepena oksidacije, zbog čega ga dobavljači za histologiju prodaju kao zaseban proizvod sa sopstvenim ispitivanjem učinka, a ne kao odležalo Loefflerovo sredstvo. Tipične primene obuhvataju metahromatski prikaz granula mastocita, mucina i hrskavice, detalja plazma ćelija i Helicobacter pylori u presecima tkiva polihromnim metodama tipa Goodpasture. To je pravi izbor kada je cilj razlikovanje pomoću boje, a pogrešan kada protokol očekuje jasnu monohromnu siluetu bakterija.

Poređenje formulacija i namene

Čitajte tabelu kao postupak za donošenje odluke. Ako se uzorak boji preslabo, promenite pristup zasnovan na pH i posegnite za Loefflerovim sredstvom. Ako se sve oboji, ali se ništa međusobno ne razlikuje, promenite izbor boja i posegnite za polihromnim sredstvom. Ako Loefflerov razmaz odlično prikazuje granule, ali nadređeni pita zašto su jedra i citoplazma iste plave boje, odgovor je da nijedno alkalno monohromno sredstvo za bojenje ne može da obavi taj zadatak. To pitanje pripada polihromnoj porodici i njenim derivatima za bojenje krvi.

Izbegavanje uobičajenih zabuna

Dve greške objašnjavaju najveći deo zabune. Prva je smatrati da su Loefflerovo i obično metilensko plavo međusobno zamenljivi zato što oba izgledaju plavo u boci. Razlikuju se po pH i intenzitetu, a zamena Loefflerovog sredstva neutralnom bojom tamo gde je ono propisano dovodi do gubitka upravo onog kontrasta granula na kojem se protokol zasniva. Druga je smatrati bilo koje staro ili slučajno odležalo alkalno plavo polihromnim sredstvom. Nekontrolisano starenje daje nepoznatu smešu nepoznate jačine, dok se pravi polihromni rastvori pripremaju definisanim postupcima oksidacije i, u porodici sredstava za bojenje krvi, kombinuju sa odmerenom količinom eozina. Istorija je ovde poučna: nestabilne vodene rastvore dobijene sazrevanjem iz 1890-ih zamenile su stabilizovane metanolne formulacije upravo zato što se nekontrolisane smeše nisu mogle reprodukovati. Vredi se prisetiti te pouke pre bojenja dijagnostičkog preparata rastvorom iz boce nepoznate starosti.

Preciznost u nazivima zaokružuje ovu priču. Proverite kataloški artikal (vodeno, Loefflerovo ili polihromno sredstvo), sadržaj boje i predviđenu primenu na etiketi, umesto da zaključujete prema boji. Ove tri formulacije potiču od istog hromofora. Nemaju istu namenu.