Jednostavno bojenje metilenskim plavim naspram bojenja po Gramu: šta svaka metoda može da dokaže

Student priprema razmaz iz kulture označene kao E. coli, prekriva ga metilenskim plavim tokom jednog minuta, ispira i posmatra kroz imerzioni objektiv. Plavi štapići prekrivaju vidno polje. U laboratorijskom izveštaju piše: „Gram-negativni štapići identifikovani kao E. coli.“ Zapažanje je tačno. Zaključak nije potkrepljen tim preparatom.

Greška je konceptualna, a ne tehnička. Student je jednostavno bojenje tretirao kao da je diferencijalni test. Jednostavno bojenje i bojenje po Gramu odgovaraju na različita pitanja jer se zasnivaju na različitim principima bojenja. Jedno pita: koji je oblik prisutan. Drugo pita: kako se ćelijski zid ponaša kada se podvrgne testu. Ako pomešate ta dva, pravilno obojen preparat dovodi do neutemeljenog izveštaja.

Ovo poređenje jasno razdvaja dve metode, pokazuje koje tvrdnje svaki rezultat opravdava i odgovara na dva pitanja koja studenti najčešće postavljaju: može li se metilensko plavo koristiti u bojenju po Gramu i šta bojenje E. coli metilenskim plavim zaista pokazuje.

Kratak odgovor

Jednostavno bojenje metilenskim plavim boji svaku ćeliju koja može da se oboji istom plavom bojom, pa otkriva morfologiju (štapiće, kugle, spirale) i raspored (pojedinačno, u parovima, u lancima), ali ništa o Gram-kategoriji. Bojenje po Gramu dodaje jod, korak obezbojavanja i kontrastnu boju, pa razdvaja bakterije na Gram-pozitivne (ljubičaste) i Gram-negativne (ružičaste ili crvene) prema tome kako njihovi ćelijski omotači zadržavaju boju. Plavi štapići nakon bojenja metilenskim plavim znače „prisutne su ćelije štapićastog oblika“. Ružičasti štapići nakon celog postupka bojenja po Gramu znače „prisutni su Gram-negativni štapići“. Druga tvrdnja je snažnija jer je postupak uključio dodatni test.

Za širu grupu metoda bojenja bakterija jednom bojom, kojoj pripada i tema ovog članka, pogledajte atlas bojenja za mikroskopiju.

Jednostavno bojenje: jedna boja, jedno pitanje

Metilensko plavo je bazna (katjonska) boja. Njegov obojeni jon nosi pozitivno naelektrisanje i vezuje se za negativno naelektrisane strukture u ćeliji, uključujući nukleinske kiseline i kisele površinske grupe, pa ćelije izgledaju plavo na svetloj pozadini. OpenStax opisuje ovaj princip pozitivnog bojenja u svom poglavlju o bojenju. Sam katjon boje je mali, pljosnati fenotiazinski jon detaljno opisan u referentnom članku o hemiji metilenskog plavog; hloridni protivjon ne daje boju.

Standardni nastavni protokol namerno je jednostavan: napraviti tanak razmaz, osušiti na vazduhu, fiksirati toplotom, prekriti približno 1% vodenim rastvorom metilenskog plavog tokom otprilike jednog minuta, nežno isprati vodom, osušiti upijanjem i pregledati uz uljnu imerziju. Nastavni protokol na LibreTexts navodi upravo ovu varijantu sa 1% rastvorom tokom jednog minuta, uz napomenu da neke laboratorije produžavaju vreme. Bez mordanta, bez sredstva za obezbojavanje, bez druge boje. Upravo je to odsustvo suština. Sa samo jednom bojom i bez selektivnog uklanjanja, svaka ćelija koja vezuje boju na kraju ima istu boju.

Kod E. coli, očekivano vidno polje sadrži plave štapiće (bacile), pojedinačno, u parovima ili u malim grupama. Plava boja potiče od boje za bojenje. Štapićasti oblik potiče od organizma. Ali ta kombinacija ne identifikuje organizam, jer su mnoge vrste štapićastog oblika i mnogi štapići se pri jednostavnom bojenju oboje plavo. ATCC izričito navodi ovo ograničenje na morfologiju u svom vodiču za mikrobiološke kulture. Ispravan izveštaj glasi: „uočeni su plavi bacili“. Za sve izvan oblika i rasporeda potrebno je više dokaza.

Bojenje po Gramu: četiri reagensa, jedan test ponašanja

Bojenje po Gramu je diferencijalno bojenje. Sve ćelije podvrgava istom nizu koraka i pokazuje koje ćelije zadržavaju prvu boju, a koje je gube. Protokoli Američkog društva za mikrobiologiju za bojenje po Gramu definišu standardni redosled od četiri koraka: kristal violet (primarna boja), Gramov jod (mordant), alkohol ili smeša acetona i alkohola (sredstvo za obezbojavanje), zatim safranin (kontrastna boja).

Standardni nastavni model objašnjava ovu podelu strukturom ćelijskog omotača. Gram-pozitivne ćelije imaju debeo peptidoglikanski zid koji dehidrira i zadržava kompleks kristal violeta i joda tokom ispiranja alkoholom. Gram-negativne ćelije imaju tanak peptidoglikanski sloj i spoljašnju membranu bogatu lipidima, koju sredstvo za obezbojavanje narušava, pa se kompleks ispira, a ćelije zatim primaju safranin. Pregled bojenja po Gramu na NCBI Bookshelf daje ovo objašnjenje zasnovano na ćelijskom zidu. Stručnjaci dodaju da je celokupna fizičko-hemijska slika složenija od same debljine zida, ali za tumačenje u laboratoriji pravilo ponašanja ostaje važeće: ljubičasto znači da je boja zadržana, a ružičasto da je izgubljena, pa zamenjena kontrastnom bojom.

Ilustrativni prikazi. Stilizovani crteži za poređenje metoda, ne mikrofotografije snimljene kamerom. Boje su pojednostavljene radi objašnjenja principa: jedna boja pri jednostavnom bojenju, dve boje nakon obezbojavanja u postupku bojenja po Gramu.

Može li se metilensko plavo koristiti u bojenju po Gramu

Ovo pitanje ima dva značenja, koja zahtevaju različite odgovore.

Prvo značenje: može li jednokratno prekrivanje metilenskim plavim da zameni ceo postupak bojenja po Gramu. Ne. Bez joda, sredstva za obezbojavanje i kontrastne boje nema diferencijalnog koraka, pa se Gram-kategorija ne ispituje. Plavo vidno polje nakon upotrebe samo metilenskog plavog predstavlja rezultat jednostavnog bojenja, čak i ako bočica stoji pored reagenasa za bojenje po Gramu. Nemojte ga beležiti kao rezultat bojenja po Gramu.

Drugo značenje: može li metilensko plavo da zameni safranin kao kontrastnu boju u koraku 4. Funkcionalno, ono može da oboji obezbojene ćelije, a udžbenička vežba predviđa ljubičaste Gram-pozitivne ćelije i plave Gram-negativne ćelije nakon takve zamene. Ovaj princip je ispravan jer su pravilno obezbojene Gram-negativne ćelije gotovo bezbojne i primiće drugu katjonsku boju. Ali to nije standardni protokol. ASM protokoli propisuju safranin, uz priznate alternative poput baznog fuksina u nekim varijantama, a ne metilensko plavo. Postoji i praktičan nedostatak: plavu i ljubičastu teže je razlikovati nego ružičastu i ljubičastu, posebno početnicima i naročito pri osvetljenju dotrajalim mikroskopskim lampama. Za nastavu i svaki rezultat koji je važan koristite kontrastnu boju navedenu u vašem protokolu, obično safranin, a metilensko plavo kao kontrastnu boju tretirajte kao demonstracionu varijantu, a ne kao ravnopravan standard.

Srodno pitanje o tome kako se metilensko plavo poredi sa drugim opcijama koje koriste jednu boju obrađeno je u poređenju jednostavnih bojenja bakterija.

Šta bojenje E. coli metilenskim plavim dokazuje, a šta ne

E. coli je Gram-negativni štapić, ali ta rečenica objedinjuje činjenice dobijene različitim metodama: morfologiju iz mikroskopije, Gram-reakciju iz bojenja po Gramu, identitet iz kultivacije i biohemijskog ili molekularnog ispitivanja. Razmaz obojen metilenskim plavim doprinosi samo prvom delu. On utvrđuje da su u obojenom uzorku prisutne ćelije štapićastog oblika i pokazuje njihov raspored. Ne utvrđuje Gram-reakciju jer nije sproveden test obezbojavanja. Ne identifikuje vrstu jer štapići mnogih vrsta izgledaju slično pri ovoj rezoluciji.

Tu izveštaji greše na predvidljiv način. Autor unosi prethodno znanje („ova kultura bi trebalo da bude E. coli, a E. coli je Gram-negativna“) u opis zapažanja, pa izgleda kao da preparat potvrđuje ono što je zapravo pretpostavljeno. Jasniji izveštaj razdvaja te nivoe: „Jednostavno bojenje metilenskim plavim: uočeni su plavi bacili; samo morfologija, Gram-kategorija nije ispitana.“ Zatim, ako je bojenje po Gramu pravilno izvedeno uz kontrole: „Bojenje po Gramu: ružičasti štapići, u skladu sa Gram-negativnom reakcijom.“ Identitet vrste dolazi kasnije, iz postupka identifikacije, a ne samo iz boje.

Praktičan vodič za tumačenje

Koristite ovo pravilo odlučivanja pri radu u laboratoriji. Ako su sve ćelije iste boje, a protokol je koristio jednu boju bez sredstva za obezbojavanje, sproveli ste jednostavno bojenje. Navedite oblik, procenjenu veličinu i raspored. Tu se zaustavite. Ako je protokol uključivao kristal violet, jod, sredstvo za obezbojavanje i kontrastnu boju, uz poznate pozitivne i negativne kontrole, sproveli ste bojenje po Gramu. Navedite boju i morfologiju: ljubičaste koke u lancima, ružičaste štapiće i tako dalje.

Tri greške uzrokuju većinu zabuna. Prva je preterano tumačenje plavih štapića kao potvrde E. coli. Druga je beleženje preparata obojenog metilenskim plavim pod naslovom „Bojenje po Gramu“ u beležnici, što će kasniji čitaoci pogrešno protumačiti. Treća je proizvoljna zamena kontrastnih boja, a zatim poređenje boja između laboratorija kao da su korišćene iste palete. Sve tri greške ispravljaju se na isti način: navedite metodu koja je zaista sprovedena i tvrdite samo ono što ta metoda ispituje.

Jednostavno bojenje opravdava svoje mesto upravo zato što omogućava ograničene zaključke. Brzo je, toleriše manja odstupanja u izvođenju i dovoljno je kada je pitanje morfologija: da li je nešto prisutno i kakvog je oblika. Kada je pitanje klasifikacija, sprovedite diferencijalni test. Plavi preparat pokazuje kako ćelije izgledaju. Ljubičasti ili ružičasti preparat pokazuje kako se njihovi zidovi ponašaju. Nijedan preparat, sam za sebe, ne otkriva vrstu.