Bojenje ćelija obraza metilenskim plavim: šta posmatrati

Učenica stavlja kap suspenzije ćelija obraza na predmetno staklo, pogleda kroz mikroskop i ne vidi gotovo ništa. Nekoliko bledih senki prolazi kroz svetlo vidno polje. Pokušava da izoštri sliku, zatim pojačava osvetljenje, pa zaključuje da je preparat prazan. Preparat nije prazan. Ćelije su tu. Gotovo su providne, a upravo je providnost problem koji ovo bojenje treba da reši.

Na taj nesklad između očekivanja i slike vredi ukazati pre početka postupka. Početnici očekuju da mikroskop otkrije detalje kao što zumiranje kamerom otkriva udaljeni natpis. Mikroskop sa svetlim poljem ima užu ulogu: prikazuje razlike u apsorpciji svetlosti. Neobojena ćelija obraza gotovo uopšte ne apsorbuje svetlost, pa gotovo i ne stvara razliku. Metilensko plavo uvodi tu razliku. Neravnomerno se vezuje unutar ćelije i pretvara strukturu u kontrast. Kada učenici shvate taj koncept, svaki naredni korak deluje kao njegova posledica, a ne kao recept.

Ovde pomaže osnovno znanje o tome kako jednostavna bojenja stvaraju kontrast u školskoj laboratoriji, a podsećanje na podešavanje mikroskopa sa svetlim poljem pre bojenja sprečava polovinu neuspelih preparata. Hemija koja stoji iza boje objašnjena je u uvodu u primenu metilenskog plavog u mikroskopiji, koji opisuje zašto se baš ova boja tako često koristi u laboratoriji.

Protokol za nastavu

Verzija sa vlažnim preparatom opisana u nastavku jednostavniji je osnovni izbor za redovnu nastavu. Ne zahteva plamen ni korak fiksacije. Varijanta sa fiksiranim razmazom, koja se koristi u nekim fakultetskim priručnicima, uključuje sušenje na vazduhu i kratku toplotnu fiksaciju, kao u vežbi sa razmazom ćelija obraza koledža North Central Texas College, objavljenoj na platformi Biology LibreTexts, ali toplotna fiksacija je uobičajena praksa u mikrobiologiji, a ne uslov za posmatranje epitelnih ćelija.

Šta vam je potrebno: čista predmetna i pokrovna stakla, sterilni brisevi za jednokratnu upotrebu (poželjno) ili nove pljosnate čačkalice, bočica sa kapaljkom sa vodenim rastvorom metilenskog plavog koncentracije od 0.5 do 1 procenat, destilovana ili dejonizovana voda, upijajući papir, rukavice i složeni mikroskop sa ukupnim uvećanjima 100x i 400x.

1. Isperite usta običnom vodom. Time se uklanjaju čestice hrane koje bi se kasnije intenzivno obojile i odvlačile pažnju od ćelija.
2. Svaki učenik uzima uzorak samo sa sopstvenog obraza. Novim sterilnim brisom nežno protrljajte unutrašnju stranu obraza. Pritisnite, nemojte strugati. Prekinite mnogo pre nego što se pojave nelagodnost ili krvarenje.
3. Valjanjem brisa nanesite tanak sloj preko sredine čistog predmetnog stakla. Tanak sloj je najvažniji pojedinačni uslov za preparat koji se može jasno posmatrati. Debela bela naslaga obojiće se u plavu masu u kojoj se ništa ne može razaznati.
4. Dodajte jednu kap metilenskog plavog preko razmaza. Ostavite je da deluje 1 do 3 minuta. U mnogim fakultetskim protokolima dovoljan je jedan minut; NCERT priručnik za laboratorijske vežbe iz prirodnih nauka za IX razred predviđa oko 3 minuta za privremeni preparat. Duže nije bolje, a prekomerno bojenje je najčešća greška u trajanju postupka.
5. Nežno isperite destilovanom vodom ili uklonite višak boje upijajućim papirom, u skladu sa lokalnim protokolom. Pozadina treba da postane bledoplava, a ne tamnoplava.
6. Spustite pokrovno staklo pod uglom tako da jedna ivica prva dodirne preparat, a zatim ga polako spustite do kraja. Time se sprečava zarobljavanje mehurića vazduha.
7. Počnite pri malom uvećanju da biste pronašli ćelije, proverili fokus i centriranje, zatim pređite na 100x i na kraju na 400x. Pri 400x koristite samo fino podešavanje fokusa.

Koncentraciju boje treba precizirati u jednoj rečenici. Školski protokoli uglavnom koriste vodeni rastvor metilenskog plavog koncentracije oko 1 procenat. Koncentrovaniji osnovni rastvor ili duže izlaganje brže pojačavaju boju pozadine nego jedra, čime se preokreće kontrast od kojeg ova vežba zavisi.

Bezbedno rukovanje materijalom sa obraza

Uzorci sa obraza sadrže pljuvačku i uobičajene mikroorganizme usne duplje, zato svaki svež razmaz tretirajte kao potencijalno infektivan materijal, iako su davaoci zdravi učenici iz istog odeljenja. Smernice Američkog društva za mikrobiologiju o biološkoj bezbednosti u nastavnim laboratorijama navode opšta načela: procenite rizik pre časa, nosite rukavice, zaštitite oči tamo gde je moguće prskanje, operite ruke nakon rada, dezinfikujte radne površine i odložite kontaminirani materijal za jednokratnu upotrebu prema odobrenom postupku za biološki otpad.

Četiri pravila za nastavu pokrivaju najveći deo rizika. Jedan davalac po brisu i po predmetnom staklu, bez deljenja. Svako uzima uzorak samo od sebe, nikada od učenika pored sebe. Brisevi i čačkalice za jednokratnu upotrebu idu pravo u predviđenu posudu za otpad, nikada nazad na radnu površinu. Samo metilensko plavo ostavlja mrlje na koži i odeći i nadražuje oči, zato su potrebne rukavice i uobičajene mere higijene pri radu sa bojama. Ne proširujte ovu vežbu na uzgajanje bilo čega iz razmaza i ne improvizujte toplotnu fiksaciju svežeg ljudskog materijala mimo školskog bezbednosnog postupka.

Šta posmatrati i zašto tako izgleda

Pri 100x potražite široke, pljosnate, bledoplave ćelije sa nepravilnim ovalnim ili poligonalnim obrisima. Nalaze se pojedinačno ili u rastresitim slojevima koji se preklapaju. Svaka ćelija obično ima jednu tamniju plavu tačku. Ta tačka je jedro. Obratite pažnju i na raspored: ćelije pločastog epitela su tanke pločice, a ne sfere, zbog čega njihove ivice podsećaju na ispucalu glazuru, a ne na okrugle balone.

Pri 400x jasno se razaznaju tri obeležja. Granica ćelije izgleda kao tanka, tamnija linija koja je okružuje. Citoplazma ispunjava unutrašnjost svetlom, ravnomernom plavom bojom. Jedro je tamnije i kompaktnije, često ovalno, obično blizu centra, ali ne uvek. Tražite od učenika da zabeleže sva tri obeležja, kao i oblik i uvećanje, jer radni list traži upravo to.

Ovde je važna jedna napomena o tačnosti koju mnogi radni listovi pogrešno predstavljaju. Vidljiva granica odgovara području plazma membrane, ali sama membrana, lipidni dvosloj debljine približno 7 do 10 nanometara, daleko je ispod moći razlučivanja školskog mikroskopa. Učenici vide optičku ivicu ćelije i boju koja se tu nakupila. Isti oprez važi i za organele. Mitohondrije, endoplazmatični retikulum, Golgijev aparat i ribozomi nisu vidljivi u ovom preparatu. Konvencionalni svetlosni mikroskop u dobrim uslovima može da razluči detalje do približno 0.2 mikrometra, kako objašnjava NCBI pregled mikroskopskih alata u ćelijskoj biologiji, a najveći deo ultrastrukture nalazi se ispod te granice ili blizu nje. Veće prazno uvećanje povećava sliku bez dodavanja detalja.

Zašto se jedro boji najtamnije? Metilensko plavo je katjonska boja, pozitivno naelektrisana u rastvoru, koja se vezuje za negativno naelektrisan materijal u ćeliji, pre svega za nukleinske kiseline. Hromatin koncentriše DNK u jedru, pa jedro vezuje najviše boje. Citoplazma sadrži RNK i druge naelektrisane molekule, pa se i ona boji, ali difuznije i svetlije. Ključna ograda: metilensko plavo nije boja specifična za DNK. Rad o raspodeli metilenskog plavog pri snimanju jedara opisuje vezivanje katjona za područja bogata nukleinskim kiselinama, a starije kvantitativno istraživanje o vezivanju metilenskog plavog u ćelijskim preparatima pokazalo je da je najveći deo vezane boje povezan sa nukleinskim kiselinama. Tamno jedro i svetla citoplazma zato predstavljaju obrazac kontrasta, a ne molekularnu analizu.

Greške koje će učenici praviti i kako ih prepoznati

Gotovo svaki neuspeo preparat pripada jednom od pet obrazaca. Naučite učenike da prepoznaju problem na preparatu umesto da ga slepo ponavljaju.

Prekomerno bojenje čini ćelije i pozadinu jednolično tamnim, pa se jedro gubi u vidnom polju. Ispravite to kraćim vremenom bojenja ili temeljnijim ispiranjem. Nedovoljno bojenje ostavlja blede senke koje nestaju kada se pojača osvetljenje; produžavajte bojenje u koracima od trideset sekundi. Debeli razmazi stvaraju guste mase preklopljenih ćelija u kojima se nijedan obris ne može pratiti; korekcija je mehanička — sledeći put razmažite tanji sloj, jer nijedno ispiranje ne može popraviti gomilu ćelija. Mehurići vazduha izgledaju kao savršeni krugovi sa oštrim, tamnim rubovima i odvlače pažnju početnicima koji ih mešaju sa strukturama; ponovo postavite pokrovno staklo polako i pod uglom. Sitne tamne tačke rasute po ćelijama ili oko njih obično su uobičajene bakterije usne duplje, kako navode školski protokoli poput postupka za posmatranje ćelija obraza na sajtu Ingrid Science. One potvrđuju da je usna duplja naseljena mikroorganizmima, što učenicima može ostati u sećanju, ali se u ovoj vežbi ne mogu odrediti do nivoa vrste i ne treba ih crtati kao delove ćelije. Ostaci hrane i niti sluzi boje se nepravilno i intenzivno; početno ispiranje služi da ih bude manje.

Šta ova vežba ne može da pokaže

Ovo je posmatranje u obrazovne svrhe, a ne dijagnostički test. Na osnovu izgleda ćelija obojenih u okviru nastave ne može se dijagnostikovati infekcija, rak niti bilo koja bolest, i članak ne treba tumačiti kao da sugeriše suprotno. Preparat prikazuje oblik, granicu, citoplazmu i jedro pri dva uvećanja. Ne prikazuje ultrastrukturu membrane, detalje organela niti molekularni identitet. Jasno navođenje ograničenja štiti i naučnu tačnost i učenike: dobar rezultat je pravilno označen crtež sa zabeleženim uvećanjem i korišćenom bojom, a ne zaključak o zdravlju.

Radni list za učenike i označene mikrografije

Dva prateća materijala pripremljena za ovu stranicu jesu označena mikrografija iznad i radni list ispod. Odštampajte po jedan radni list za svakog učenika ili ga projektujte i zamolite učenike da precrtaju polja u sveske.

Kako ga koristiti tokom časa od 45 minuta: deset minuta za bezbednosna uputstva i uzimanje uzoraka, deset minuta za bojenje i postavljanje pokrovnog stakla, petnaest minuta za posmatranje i skiciranje pri oba uvećanja, deset minuta za kontrolnu listu i poređenje sa označenom mikrografijom. Stavke kontrolne liste namerno se odnose na konkretne korake. Tanak razmaz, odgovarajuće vreme bojenja, jedro tamnije od citoplazme, zabeleženo uvećanje. Učenik koji može da potvrdi sve četiri stavke razumeo je koncept koji ova lekcija treba da prenese: mikroskopi prikazuju razlike, a boje stvaraju razlike koje vredi prikazati.