Pse bluja e metilenit përdoret si ngjyrues kontrastues në ngjyrosjen acidorezistente

Një teknik shqyrton një preparat të shtrirë të pështymës pas përfundimit të gjithë sekuencës së ngjyrosjes. Shkopinjtë e kuq dallohen mbi një fushë blu dhe raporti lëshohet me shënimin se janë parë bacile acidorezistente. Të nesërmen, një lamë tjetër tregon një fushë blu të njëtrajtshme pa shkopinj të kuq dhe raportohet si negative për tuberkuloz. Njëri prej këtyre raporteve pohon më shumë sesa mbështet lama, dhe nuk është i pari.

Ngatërrimi është konceptual. Tekniku e trajtoi ngjyruesin blu si pjesë të kimisë së zbulimit, sikur bluja e metilenit të ndihmonte në gjetjen e mikobaktereve. Nuk e bëri këtë. Në çastin kur bluja e metilenit prek lamën, prova tashmë ka përfunduar. Ngjyruesi vetëm ngjyros sfondin, që rezultati të jetë i lexueshëm. Ky artikull shpjegon qëllimin e blusë së metilenit në ngjyrosjen acidorezistente, pse përdoret bluja dhe jo ndonjë ngjyrë tjetër, dhe çfarë përfundimesh ju lejon të nxirrni e kuqja mbi sfondin blu.

Përgjigjja e shkurtër

Ngjyrosja acidorezistente është një provë diferenciale e ndërtuar mbi tri ide. Fuksina karbolike, ngjyruesi parësor, futet me forcë në çdo qelizë, përfshirë mikobakteret me mbështjellës dyllor. Acid-alkooli, çngjyruesi, e largon ngjyruesin e kuq nga qelizat e zakonshme, por nuk arrin ta nxjerrë nga ato acidorezistente. Bluja e metilenit, ngjyruesi kontrastues, pastaj ngjyros gjithçka nga e cila çngjyruesi ka larguar ngjyruesin, kështu që qelizat joacidorezistente, qelizat e bujtësit dhe mbetjet duken blu, ndërsa bacilet acidorezistente mbeten të kuqe. Ngjyruesi kontrastues siguron kontrast. Ai nuk luan asnjë rol në kiminë që e bën një qelizë acidorezistente.

Çfarë bën secili hap

Diagrami më poshtë tregon ndarjen e roleve. Lexojeni nga e majta në të djathtë si procedurë dhe lexojeni shiritin e poshtëm si kujtesë se çdo familje ngjyrosjesh i përgjigjet një pyetjeje të ndryshme.

Depërtimi vjen i pari. Mikobakteret u rezistojnë ngjyruesve të zakonshëm ujorë, sepse mbështjellësi i tyre është jashtëzakonisht hidrofob, ndaj protokolli detyron depërtimin. Në metodën Ziehl-Neelsen, ngrohja deri në formimin e avullit e shtyn fuksinën karbolike që përmban fenol përmes murit dyllor. Në metodën e ftohtë Kinyoun, nxehtësia zëvendësohet me një formulim shumë më të përqendruar të ngjyruesit parësor, ndërsa disa variante të modifikuara pa ngrohje shtojnë surfaktantë. Protokollet e ngjyrosjes acidorezistente të Shoqatës Amerikane për Mikrobiologji i dokumentojnë të dyja formulimet krah për krah dhe ndryshimi në përqendrim është i dukshëm: afërsisht 0.3 g fuksinë bazike për 100 mL për metodën me ngrohje, kundrejt rreth 4 g për metodën e ftohtë.

Diferencimi vjen i dyti. Acid-alkooli, zakonisht 3 mL acid klorhidrik i përqendruar në 97 mL etanol 95 për qind, e shpëlan ngjyruesin e kuq nga çdo qelizë, muri i së cilës nuk ofron ndonjë rezistencë të veçantë. Qelizat me mbështjellësin lipidik mikobakterial të paprekur e mbajnë ngjyruesin. Ky është hapi nga i cili varet e gjithë metoda dhe hapi më i ndjeshëm ndaj teknikës, siç diskutohet më poshtë.

Kontrasti vjen i fundit. Lama tani përmban qeliza acidorezistente të kuqe mbi një sfond pothuajse pa ngjyrë të qelizave që e kanë humbur ngjyruesin. Bluja e metilenit në përqendrim 0.3 për qind w/v e bën sërish të dukshëm atë sfond, në një ngjyrë sa më të largët nga e kuqja. Ngjyrosja kontrastuese është e shkurtër, zakonisht 20 deri në 30 sekonda në metodën me ngrohje dhe deri në disa minuta në disa variante të metodës së ftohtë; kohëzgjatja varet nga protokolli dhe nuk është veti e vetë ngjyruesit.

Pse ky ngjyrues dhe pse blu

Bluja e metilenit është një ngjyrues bazik kationik, që do të thotë se joni i saj me ngjyrë mbart një ngarkesë pozitive dhe lidhet me sipërfaqet e ngarkuara negativisht të baktereve të çngjyrosura, qelizave të bujtësit dhe mbetjeve. Mikrobiologjia e OpenStax e përshkruan këtë logjikë të ngarkesës si parimin e përgjithshëm mbi të cilin mbështeten ngjyruesit bazikë. Por bluja e metilenit nuk është kimikisht e veçantë këtu. Edhe violeti kristal dhe safranina janë ngjyrues bazikë. Zgjedhja është optike, jo kimike.

Shkopinjtë e kuq kanë nevojë për një sfond me nuancë kontrastuese dhe bluja ofron kontrastin më të dobishëm me të kuqen për mikroskopinë me fushë të ndritshme. Safranina do të ishte një ngjyrues kontrastues i papërshtatshëm, sepse ngjyra e saj përfundimtare rozë-e kuqe është tepër e afërt me fuksinën karbolike të mbajtur, duke zhdukur pikërisht dallimin që krijoi procedura. Violeti kristal do të jepte një sfond vjollcë të errët, që konkurron me bacilet e holla të kuqe për vëmendje. Prova më e fortë se roli është kontrasti dhe jo kimia është zëvendësimi: ngjyrues kontrastues të gjelbër, si e gjelbra e malakitit dhe e gjelbra brilante, përdoren në disa protokolle veterinare dhe të modifikuara, dhe prova ende funksionon, sepse çdo nuancë qartësisht e ndryshme kryen të njëjtin rol.

Nga kjo rrjedhin dy përfundime praktike. Së pari, receta standarde nuk përcakton ndonjë rregullim të pH-së; mos e ngatërroni këtë tretësirë të thjeshtë ujore 0.3 për qind me formulime alkaline si bluja e metilenit e Loeffler-it, të cilat i përkasin një koncepti tjetër ngjyrosjeje. Së dyti, teprimi dëmton. Literatura e histologjisë paralajmëron posaçërisht se një sfond blu tepër i dendur mund të fshehë bacile të pakta, ndaj mbajtja e lamës të mbuluar me ngjyrues më gjatë sesa lejon protokolli e ul lexueshmërinë pa sjellë ndonjë përfitim.

Kimia e murit që e bën të mundur provën

Arsyeja pse acid-alkooli bën dallimin qëndron te mbështjellësi mikobakterial. Bërthama e tij strukturore është kompleksi mikolil-arabinogalaktan-peptidoglikan: peptidoglikani i lidhur me arabinogalaktanin, skajet e jashtme të të cilit mbartin acide mikolike me zinxhirë shumë të gjatë, duke formuar një mikomembranë të jashtme të pasur me lipide dhe me përshkueshmëri jashtëzakonisht të ulët. Artikulli rishikues mbi membranën e jashtme mikobakteriale e përshkruan në hollësi këtë arkitekturë. Barriera vepron në të dyja drejtimet. Ajo i reziston hyrjes së ngjyruesit, prandaj depërtimi kërkon nxehtësi ose një ngjyrues parësor më të përqendruar, dhe i reziston nxjerrjes së ngjyruesit, prandaj acid-alkooli nuk arrin ta largojë fuksinën karbolike pasi ajo ka hyrë brenda. Bakteret e zakonshme nuk e kanë këtë mbështjellës dhe e humbin ngjyruesin. Prandaj, acidorezistenca kuptohet më mirë si një dukuri e barrierës lipidike, jo si lidhje kimike e fuksinës me acidin mikolik.

Kjo kimi shpjegon edhe një dukuri që shpesh krijon paqartësi: mikobakteret ngjyrosen dobët dhe në mënyrë të paparashikueshme me metodën Gram, duke u shfaqur ndonjëherë si forma të zbehta me pamje kokrrizore ose si konture të pangjyrosura. Muri i tyre hidrofob kufizon depërtimin e violetit kristal. Ngjyrosja acidorezistente nuk është një ngjyrosje Gram e modifikuar. Ajo është një parim tjetër diferencial, i ndërtuar rreth një vetie tjetër të murit, siç tregon krahasimi i ngjyrosjes së thjeshtë me ngjyrosjen Gram për dy metodat e tjera.

Tri metoda, tri pyetje

Për familjen më të gjerë të metodave bakteriale me një ngjyrues, shihni atlasin e ngjyrosjes në mikroskopi.

Çfarë nuk mund të vërtetojë e kuqja mbi sfondin blu

Shkopinjtë e kuq nënkuptojnë se organizmat e mbajtën fuksinën karbolike gjatë trajtimit me acid-alkool. Ky konstatim përputhet me Mycobacterium tuberculosis, por udhëzimi i CDC-së për diagnostikimin e tuberkulozit vëren shprehimisht se edhe mikobaktere të tjera janë acidorezistente, ndaj identifikimi i species kërkon kulturë dhe testim të acideve nukleike, jo ngjyrë.

Gabimet teknike përqendrohen rreth dy shpëlarjeve. Çngjyrosja e pamjaftueshme e lë materialin e sfondit të kuq dhe favorizon interpretime pozitive të rreme. Çngjyrosja e tepërt largon ngjyruesin parësor të mbajtur dobët dhe kontribuon në rezultate negative të rreme. Një ngjyrues kontrastues i aplikuar me tepricë i fsheh bacilet e pakta në sfondin blu. Preparatet e trasha, reagentët e precipituar dhe uji i ndotur i shpëlarjes shtojnë artefaktet e tyre.

Ndjeshmëria kufizohet nga ngarkesa e organizmave, pavarësisht sa e saktë është teknika. Mikroskopia konvencionale e preparatit të shtrirë kërkon afërsisht 5,000 deri në 10,000 bacile për mililitër pështymë, dhe rishikimet më të hershme të provave shkencore nga CDC-ja e vlerësonin ndjeshmërinë e kësaj mikroskopie rreth 45 deri në 80 për qind ndër rastet pulmonare të konfirmuara me kulturë. Prandaj, një preparat negativ nuk e përjashton kurrë tuberkulozin. Udhëzimi aktual i CDC-së ruan kulturën krahas çdo preparati dhe rekomandon testimin me amplifikim të acideve nukleike në të paktën një mostër respiratore kur merret në konsideratë tuberkulozi pulmonar dhe rezultati do të ndryshonte menaxhimin klinik.

Puna praktike duhet të ndjekë protokollet e autorizuara

Përshkrimet mësimore, përfshirë këtë artikull, nuk autorizojnë punë klinike. Për punën në laborator, ndiqni procedurën standarde të punës të validuar të laboratorit, të harmonizuar me dokumentet aktuale të CDC-së, APHL-së ose CLSI-së; referenca e CDC-së për ngjyrosjen acidorezistente, e ruajtur në arkivin e saj Stacks, tregon se si këto procedura përcaktojnë reagentët dhe interpretimin e rezultateve. Puna me mostra për tuberkuloz kërkon masa izolimi biologjik: preparatet e shtrira përgatiten në një kabinet sigurie biologjike, sepse përgatitja gjeneron aerosole dhe spërkatje, dhe udhëzimi i CDC-së për sigurinë laboratorike thotë se edhe preparatet e fiksuara me nxehtësi mund të përmbajnë bacile tuberkulare të gjalla dhe duhet ende të trajtohen si të kontaminuara. Zëri në Bibliotekën e Imazheve të Shëndetit Publik të CDC-së për një preparat me fuksinë karbolike dhe blu metileni, të shqyrtuar për M. leprae, është një kujtesë e dobishme për fushën e përdorimit të metodës përtej tuberkulozit: i njëjti kontrast i së kuqes mbi blunë shërben kudo ku kërkohen organizma acidorezistentë, dhe një interpretim negativ i kujdesshëm është vetë një rezultat që ia vlen të regjistrohet.

Leximi i lamës së përfunduar

Ngjyruesi kontrastues e dëshmon vlerën e vet gjatë kontrollit fillestar. Një mikroskopist që e skanon preparatin me zmadhim të ulët fillimisht përdor sfondin blu për të vlerësuar cilësinë e preparatit: shpërndarje të njëtrajtshme të qelizave, qeliza të paprekura të bujtësit për fokusim dhe mungesë të precipitatit të dendur. Strukturat e kuqe të dyshimta pastaj tërheqin vëmendjen pikërisht sepse asgjë tjetër në lamë nuk është e kuqe. Konfirmimi bëhet me imersion në vaj, ku bacilet e vërteta shfaqin shkopinjtë e hollë të pritshëm, ndonjëherë pak të lakuar ose me pamje kokrrizore, dhe jo mbetje të njëtrajtshme të ngjyruesit.

Ngjyrosja e sfondit përcakton edhe terminologjinë e raportit. Një lamë me bacile të kuqe raportohet me shënimin se janë parë bacile acidorezistente, shpesh me një vlerësim gjysmë sasior sipas shkallës së laboratorit. Një lamë pa organizma të kuq raportohet me shënimin se nuk janë parë bacile acidorezistente, asnjëherë si negative për tuberkuloz. Dallimi ka rëndësi, sepse fusha blu vërteton se ngjyrosja funksionoi, qelizat morën ngjyruesin kontrastues dhe kushtet optike ishin të përshtatshme, por nuk thotë asgjë për organizmat nën kufirin e zbulimit. Një fushë blu pa struktura të kuqe është një rezultat i vlefshëm për lamën, jo një përfundim për pacientin.

Mbajeni mend ndarjen e roleve dhe raportet do të formulohen vetvetiu. Fuksina karbolike zbulon kandidatët. Acid-alkooli kryen provën. Bluja e metilenit vetëm e bën përgjigjen të lexueshme: e kuqja e mbajti ngjyruesin përballë acidit, bluja e humbi atë. Gjithçka tjetër, specia, ngarkesa dhe kuptimi klinik, përcaktohet nga puna përtej lamës.