Ngjyrosja e thjeshtë me blu metileni kundrejt ngjyrosjes Gram: çfarë mund të vërtetojë secila metodë

Një student përgatit një strisho nga një kulturë e etiketuar E. coli, e mbulon me blu metileni për një minutë, e shpëlan dhe e vëzhgon me objektivin me imersion në vaj. Shkopinj blu mbulojnë fushën e shikimit. Në raportin laboratorik shkruhet: "Shkopinj Gram-negativë të identifikuar si E. coli." Vëzhgimi është i saktë. Por kjo lamë nuk e mbështet përfundimin.

Gabimi është konceptual, jo teknik. Studenti e trajtoi një ngjyrosje të thjeshtë sikur të ishte një provë diferenciale. Ngjyrosja e thjeshtë dhe ngjyrosja Gram u përgjigjen pyetjeve të ndryshme, sepse mbështeten në koncepte të ndryshme ngjyrosjeje. Njëra pyet: çfarë forme është e pranishme. Tjetra pyet: si sillet muri qelizor kur i nënshtrohet një prove. Nëse i ngatërroni të dyja, një lamë e ngjyrosur saktë çon në një raport të pambështetur.

Ky krahasim i mban të ndara të dyja metodat, tregon çfarë ju lejon të pohoni secili rezultat dhe u përgjigjet dy pyetjeve që studentët bëjnë më shpesh: a mund të përdoret bluja e metilenit në ngjyrosjen Gram dhe çfarë tregon në të vërtetë ngjyrosja e E. coli me blu metileni.

Përgjigjja e shkurtër

Ngjyrosja e thjeshtë me blu metileni i ngjyros të gjitha qelizat që mund të ngjyrosen me të njëjtën ngjyrë blu, prandaj zbulon morfologjinë (shkopinj, sfera, spirale) dhe renditjen (veçmas, në çifte, në vargje), por asgjë për kategorinë Gram. Ngjyrosja Gram shton jod, një hap çngjyrosjeje dhe një kundërngjyrosës, prandaj i ndan bakteret në Gram-pozitive (vjollcë) dhe Gram-negative (rozë ose të kuqe), sipas mënyrës se si mbështjelljet e tyre e mbajnë ngjyruesin. Shkopinjtë blu pas ngjyrosjes me blu metileni nënkuptojnë "janë të pranishme qeliza në formë shkopi". Shkopinjtë rozë pas një sekuence të plotë Gram nënkuptojnë "janë të pranishëm shkopinj Gram-negativë". Pohimi i dytë është më i fortë, sepse procedura ka kryer një provë shtesë.

Për grupin më të gjerë të metodave bakteriale me një ngjyrues, të cilit i përket ky artikull, shihni atlasin e ngjyrosjeve për mikroskopi.

Ngjyrosja e thjeshtë: një ngjyrues, një pyetje

Bluja e metilenit është një ngjyrues bazik (kationik). Joni i saj i ngjyrosur mbart një ngarkesë pozitive dhe lidhet me struktura me ngarkesë negative në qelizë, përfshirë acidet nukleike dhe grupet acide sipërfaqësore, kështu që qelizat shfaqen blu mbi një sfond të zbehtë. OpenStax e përshkruan këtë parim të ngjyrosjes pozitive në kapitullin e vet për ngjyrosjen. Vetë kationi i ngjyruesit është joni i vogël dhe i rrafshët i fenotiazinës, i përshkruar hollësisht në referencën për kiminë e blusë së metilenit; kundërjoni klorur nuk kryen ngjyrosjen.

Një protokoll standard mësimor është qëllimisht i thjeshtë: përgatitni një strisho të hollë, thajeni në ajër, fiksojeni me nxehtësi, mbulojeni me tretësirë ujore të blusë së metilenit rreth 1% për afërsisht një minutë, shpëlajeni butësisht me ujë, thajeni me letër thithëse dhe vëzhgojeni me imersion në vaj. Një protokoll mësimor i LibreTexts jep pikërisht këtë variant me 1% për një minutë, duke vënë në dukje se disa laboratorë e zgjasin kohën. Pa mordant, pa çngjyrosës, pa ngjyrues të dytë. Pikërisht kjo mungesë është thelbi. Me vetëm një ngjyrues dhe pa heqje përzgjedhëse të tij, çdo qelizë që lidh ngjyruesin merr të njëjtën ngjyrë.

Në rastin e E. coli, në fushën e shikimit priten shkopinj blu (bacile), veçmas, në çifte ose në grupe të vogla. Ngjyra blu vjen nga ngjyruesi. Forma e shkopit vjen nga organizmi. Por ky kombinim nuk e identifikon organizmin, sepse shumë specie kanë formë shkopi dhe shumë shkopinj ngjyrosen blu në një ngjyrosje të thjeshtë. ATCC e shpreh qartë këtë kufizim vetëm te morfologjia në udhëzuesin e vet për kulturat mikrobiologjike. Një raport i saktë thotë: "u vëzhguan bacile blu". Çdo pohim përtej formës dhe renditjes kërkon më shumë prova.

Ngjyrosja Gram: katër reagentë, një provë sjelljeje

Ngjyrosja Gram është një ngjyrosje diferenciale. Ajo i nënshtron të gjitha qelizat së njëjtës sekuencë dhe tregon cilat qeliza e mbajnë ngjyruesin e parë dhe cilat e humbasin. Protokollet e ngjyrosjes Gram të Shoqatës Amerikane për Mikrobiologji përcaktojnë rendin standard me katër hapa: violeti kristal (ngjyruesi parësor), jodi i Gram-it (mordanti), alkooli ose përzierja aceton-alkool (çngjyrosësi), pastaj safranina (kundërngjyrosësi).

Modeli standard mësimor e shpjegon ndarjen përmes strukturës së mbështjelljes qelizore. Qelizat Gram-pozitive kanë një mur të trashë peptidoglikani që dehidratohet dhe e mban kompleksin violet kristal-jod gjatë shpëlarjes me alkool. Qelizat Gram-negative kanë një shtresë të hollë peptidoglikani dhe një membranë të jashtme të pasur me lipide, të cilën çngjyrosësi e çrregullon; kështu, kompleksi largohet me shpëlarjen dhe qelizat më pas marrin safraninën. Përmbledhja e ngjyrosjes Gram në NCBI Bookshelf jep këtë shpjegim të murit qelizor. Specialistët shtojnë se proceset e plota fiziko-kimike janë më të ndërlikuara sesa vetëm trashësia e murit, por për interpretimin në laborator rregulli i sjelljes mbetet i vlefshëm: vjollca nënkupton mbajtjen e ngjyruesit, ndërsa roza nënkupton humbjen e tij dhe më pas kundërngjyrosjen.

Panele ilustruese. Vizatime të stilizuara për krahasimin e metodave, jo mikrofotografi të marra me kamerë. Ngjyrat janë thjeshtuar për të shpjeguar logjikën: një ngjyrë në ngjyrosjen e thjeshtë, dy ngjyra pas çngjyrosjes Gram.

A mund të përdoret bluja e metilenit në ngjyrosjen Gram

Kjo pyetje mund të kuptohet në dy mënyra, dhe secila kërkon një përgjigje të ndryshme.

Kuptimi i parë: a mund ta zëvendësojë të gjithë sekuencën Gram një mbulim i vetëm me blu metileni. Jo. Pa jod, çngjyrosës dhe kundërngjyrosës nuk ka hap diferencial, prandaj nuk testohet asnjë kategori Gram. Një fushë blu pas përdorimit vetëm të blusë së metilenit është rezultat i ngjyrosjes së thjeshtë, edhe nëse shishja ndodhet pranë reagentëve Gram. Mos e regjistroni si rezultat Gram.

Kuptimi i dytë: a mund ta zëvendësojë bluja e metilenit safraninën si kundërngjyrosës në hapin 4. Nga ana funksionale, ajo mund t'i ngjyrosë qelizat e çngjyrosura, dhe një ushtrim në tekstin mësimor parashikon qeliza Gram-pozitive vjollcë dhe qeliza Gram-negative blu pas një zëvendësimi të tillë. Logjika është e saktë, sepse qelizat Gram-negative të çngjyrosura siç duhet janë pothuajse pa ngjyrë dhe do të marrin një tjetër ngjyrues kationik. Por ky nuk është protokolli standard. Protokollet e ASM përcaktojnë safraninën, me alternativa të njohura si fuksina bazike në disa variante, jo blunë e metilenit. Ka edhe një pengesë praktike: bluja kundrejt vjollcës dallohet më vështirë sesa roza kundrejt vjollcës, sidomos për fillestarët dhe veçanërisht nën llamba mikroskopi të konsumuara. Për punën mësimore dhe për çdo rezultat që ka rëndësi, përdorni kundërngjyrosësin që përcakton protokolli juaj, zakonisht safraninën, dhe trajtojeni kundërngjyrosjen me blu metileni si një variant demonstrues, jo si një standard të barasvlershëm.

Pyetja e lidhur me këtë, se si krahasohet bluja e metilenit me alternativa të tjera me një ngjyrues, trajtohet në një krahasim të ngjyrosjeve të thjeshta bakteriale.

Çfarë vërteton ngjyrosja e E. coli me blu metileni dhe çfarë nuk vërteton

E. coli është një shkop Gram-negativ, por kjo fjali bashkon fakte nga disa metoda: morfologjinë nga mikroskopia, reaksionin Gram nga ngjyrosja Gram dhe identitetin nga kultura së bashku me testimin biokimik ose molekular. Një strisho me blu metileni kontribuon vetëm në pjesën e parë. Ajo vërteton se në mostrën e ngjyrosur janë të pranishme qeliza në formë shkopi dhe tregon si janë të renditura. Nuk e përcakton reaksionin Gram, sepse nuk është kryer asnjë provë çngjyrosjeje. Nuk e identifikon specien, sepse shkopinjtë e shumë specieve duken njësoj në këtë nivel rezolucioni.

Pikërisht këtu raportet gabojnë në një mënyrë të parashikueshme. Shkruesi fut njohuritë paraprake ("kjo kulturë supozohet të jetë E. coli, dhe E. coli është Gram-negative") në rreshtin e vëzhgimit, kështu që lama duket sikur konfirmon atë që në fakt ishte supozuar. Një raport më i qartë i ndan nivelet: "Ngjyrosje e thjeshtë me blu metileni: u vëzhguan bacile blu; vetëm morfologji, nuk u testua asnjë kategori Gram." Pastaj, nëse ngjyrosja Gram është kryer saktë me kontrolle: "Ngjyrosje Gram: shkopinj rozë, në përputhje me rezultat Gram-negativ." Identiteti i species vjen më vonë, nga procedura e identifikimit, jo vetëm nga ngjyra.

Një udhëzues praktik për interpretimin

Përdoreni këtë rregull vendimmarrjeje në laborator. Nëse të gjitha qelizat kanë një ngjyrë dhe protokolli përdori një ngjyrues pa çngjyrosës, keni kryer një ngjyrosje të thjeshtë. Raportoni formën, vlerësimin e madhësisë dhe renditjen. Ndaluni këtu. Nëse protokolli përdori violet kristal, jod, çngjyrosës dhe kundërngjyrosës me kontrolle të njohura pozitive dhe negative, keni kryer një ngjyrosje Gram. Raportoni ngjyrën bashkë me morfologjinë: koke vjollcë në vargje, shkopinj rozë e kështu me radhë.

Tri gabime shkaktojnë shumicën e ngatërresave. Së pari, interpretimi i tepruar i shkopinjve blu si konfirmim i E. coli. Së dyti, regjistrimi i një lame me blu metileni nën titullin "Ngjyrosje Gram" në një fletore, gjë që lexuesit e mëvonshëm do ta keqinterpretojnë. Së treti, zëvendësimi pa kujdes i kundërngjyrosësve dhe më pas krahasimi i ngjyrave mes laboratorëve sikur paletat të përputheshin. Çdo gabim ka të njëjtën zgjidhje: emërtoni metodën që është kryer vërtet dhe pohoni vetëm atë që teston ajo metodë.

Ngjyrosja e thjeshtë e meriton vendin e saj pikërisht sepse pretendon pak. Është e shpejtë, toleron gabime të vogla dhe mjafton kur pyetja lidhet me morfologjinë: a ka diçka aty dhe çfarë forme ka. Kur pyetja lidhet me klasifikimin, kryeni provën diferenciale. Lama blu ju tregon si duken qelizat. Lama vjollcë ose rozë ju tregon si sillen muret e tyre. Asnjëra lamë, e vetme, nuk ju tregon specien.