Ngjyrosja e qelizave të faqes me blu metileni: çfarë të vëzhgoni

Një nxënëse vendos një pikë suspensioni të qelizave të faqes mbi një lamë, shikon në mikroskop dhe nuk sheh pothuajse asgjë. Disa hije të zbehta lëvizin nëpër një fushë të ndritshme. Ajo rregullon fokusin, pastaj shton dritën dhe më pas arrin në përfundimin se lama është bosh. Lama nuk është bosh. Qelizat janë aty. Ato janë pothuajse të tejdukshme, dhe pikërisht tejdukshmëria është problemi që kjo ngjyrosje synon të zgjidhë.

Kjo mospërputhje mes pritshmërisë dhe imazhit ia vlen të sqarohet përpara fillimit të protokollit. Fillestarët presin që mikroskopi të zbulojë hollësi ashtu si zmadhimi i një kamere zbulon një tabelë të largët. Një mikroskop me fushë të ndritshme bën diçka më të kufizuar: tregon ndryshimet në përthithjen e dritës. Një qelizë e pangjyrosur e faqes nuk përthith pothuajse fare dritë, ndaj nuk krijon pothuajse asnjë ndryshim. Blu metileni e shton këtë ndryshim. Ai lidhet brenda qelizës, në mënyrë jo të njëtrajtshme, dhe e kthen strukturën në kontrast. Pasi nxënësit ta kuptojnë këtë koncept, çdo hap pasues shihet si rrjedhojë dhe jo si recetë.

Këtu ndihmon njohja e mënyrës se si ngjyrosjet e thjeshta shtojnë kontrast në laboratorin shkollor, ndërsa një rikujtim për përgatitjen e mikroskopit me fushë të ndritshme përpara ngjyrosjes parandalon gjysmën e preparateve të pasuksesshme. Kimia që qëndron pas ngjyrës trajtohet në një hyrje në përdorimin e blusë së metilenit në mikroskopi, e cila shpjegon pse ky ngjyrues i veçantë përdoret vazhdimisht në laborator.

Protokolli për klasën

Varianti i preparatit të njomë më poshtë është zgjedhja standarde më e thjeshtë për klasat e përgjithshme. Nuk kërkon flakë dhe as ndonjë hap fiksimi. Varianti me strisho të fiksuar, i përdorur në disa manuale universitare, shton tharjen në ajër dhe një fiksim të shkurtër me nxehtësi, si në veprimtarinë me strisho nga faqja të North Central Texas College, botuar në Biology LibreTexts, por fiksimi me nxehtësi është një praktikë e mikrobiologjisë, jo një kërkesë për të parë qelizat epiteliale.

Çfarë ju nevojitet: lama dhe lamela të pastra, tamponë sterilë njëpërdorimësh (të parapëlqyer) ose kruajtëse dhëmbësh të sheshta e të reja, një shishe me pikatore me tretësirë ujore të blusë së metilenit 0.5 deri në 1 për qind, ujë të distiluar ose të dejonizuar, letër thithëse, doreza dhe një mikroskop të përbërë me zmadhim total 100x dhe 400x.

1. Shpëlajeni gojën me ujë të thjeshtë. Kjo largon grimcat e ushqimit që më vonë ngjyrosen fort dhe e largojnë vëmendjen nga qelizat.
2. Çdo nxënës merr mostër vetëm nga faqja e vet. Fërkojeni lehtë pjesën e brendshme të faqes me një tampon steril të ri. Ushtroni presion, mos gërvishtni. Ndaloni shumë përpara se të shfaqet ndonjë shqetësim ose gjakderdhje.
3. Rrotullojeni tamponin mbi qendrën e një lame të pastër, duke lënë një shtresë të hollë. Një shtresë e hollë është faktori më i rëndësishëm që përcakton nëse preparati mund të interpretohet qartë. Një depozitë e trashë e bardhë do të ngjyroset në një masë blu që nuk mund të interpretohet.
4. Shtoni një pikë blu metileni mbi strisho. Lëreni për 1 deri në 3 minuta. Një minutë mjafton në shumë protokolle universitare; manuali i laboratorit të shkencave për klasën IX i NCERT përdor rreth 3 minuta për një preparat të përkohshëm. Një kohë më e gjatë nuk është më e mirë, dhe ngjyrosja e tepërt është gabimi më i zakonshëm në kohëzgjatje.
5. Shpëlajeni lehtë me ujë të distiluar ose thithni ngjyruesin e tepërt me letër thithëse, duke ndjekur protokollin vendor. Sfondi duhet të bëhet blu i zbehtë, jo blu shumë i errët.
6. Uleni lamelën në kënd, në mënyrë që njëra anë të prekë e para, pastaj lëreni të zbresë ngadalë. Kjo pengon futjen e flluskave të ajrit.
7. Filloni me zmadhim të ulët për të gjetur qelizat, verifikoni fokusin dhe qendërzimin, pastaj kaloni në 100x dhe në fund në 400x. Në 400x përdorni vetëm rregullimin e imët të fokusit.

Përqendrimi i ngjyruesit meriton një fjali sqaruese. Protokollet shkollore përdorin zakonisht tretësirë ujore të blusë së metilenit rreth 1 për qind. Një tretësirë bazë më e përqendruar ose një ekspozim i gjatë e errëson sfondin më shpejt sesa bërthamën, duke përmbysur kontrastin nga i cili varet ushtrimi.

Trajtimi i sigurt i materialit nga faqja

Mostrat e faqes përmbajnë pështymë dhe mikroorganizma normalë të gojës, ndaj trajtojeni çdo strisho të freskët si material potencialisht infektiv, edhe pse dhuruesit janë shokë klase të shëndetshëm. Udhëzimet e biosigurisë të Shoqatës Amerikane për Mikrobiologjinë për laboratorët mësimorë përcaktojnë parimet e përgjithshme: vlerësoni rrezikun përpara seancës, mbani doreza, mbroni sytë kur mund të ketë spërkatje, lani duart më pas, dezinfektoni tavolinat e laboratorit dhe hidhni materialet njëpërdorimëshe të kontaminuara sipas procedurës së miratuar për mbetjet biologjike.

Katër rregulla në klasë mbulojnë pjesën më të madhe të rrezikut. Një dhurues për çdo tampon dhe çdo lamë; ato nuk ndahen kurrë me të tjerët. Secili merr mostër vetëm nga vetja, kurrë nga shoku pranë. Tamponët dhe kruajtëset e dhëmbëve njëpërdorimëshe shkojnë drejtpërdrejt në enën e caktuar të mbetjeve, kurrë përsëri mbi tavolinën e laboratorit. Vetë blu metileni ngjyros lëkurën dhe veshjet dhe irriton sytë, ndaj duhen doreza dhe masat e zakonshme të higjienës gjatë përdorimit të ngjyruesve. Mos e zgjeroni këtë ushtrim duke kultivuar ndonjë material nga strishoja dhe mos improvizoni fiksim me nxehtësi të materialit të freskët njerëzor jashtë procedurës së sigurisë së shkollës.

Çfarë të vëzhgoni dhe pse duket kështu

Në 100x, kërkoni qeliza të gjera e të sheshta, blu të zbehta, me konture të çrregullta ovale ose poligonale. Ato qëndrojnë veçmas ose në shtresa që mbivendosen lirshëm. Çdo qelizë zakonisht ka një njollë blu më të errët. Kjo njollë është bërthama. Vini re edhe vendosjen: qelizat epiteliale skuamoze janë pllaka të holla, jo sfera, prandaj skajet e tyre ngjajnë me smalt të plasaritur dhe jo me tullumbace të rrumbullakëta.

Në 400x dallohen qartë tri veçori. Kufiri i qelizës shfaqet si një vijë e hollë më e errët që e rrethon atë. Citoplazma mbush brendësinë me një blu të çelët e të njëtrajtshme. Bërthama është më e errët dhe më kompakte, shpesh ovale, zakonisht pranë qendrës, por jo gjithmonë. Kërkojuni nxënësve të shënojnë të tria, bashkë me formën dhe zmadhimin, sepse fleta e punës kërkon pikërisht këto.

Këtu ka rëndësi një saktësim që shumë fletë pune e paraqesin gabim. Kufiri i dukshëm përkon me zonën e membranës plazmatike, por vetë membrana, një shtresë e dyfishtë lipidike rreth 7 deri në 10 nanometra e trashë, është shumë poshtë kufirit që mund të dallojë një mikroskop shkollor. Ajo që nxënësit shohin është skaji optik i qelizës bashkë me ngjyruesin e grumbulluar aty. I njëjti kujdes vlen edhe për organelet. Mitokondritë, retikulumi endoplazmatik, aparati i Golxhit dhe ribozomet nuk shfaqen në këtë preparat. Një mikroskop optik i zakonshëm dallon hollësi deri në rreth 0.2 mikrometra në kushte të mira, siç shpjegon materiali i NCBI për biologjinë qelizore mbi mjetet e mikroskopisë, dhe pjesa më e madhe e ultrastrukturës ndodhet poshtë ose pranë këtij kufiri. Zmadhimi i mëtejshëm bosh e bën imazhin më të madh pa shtuar hollësi.

Pse bërthama ngjyroset më errët? Blu metileni është një ngjyrues kationik, me ngarkesë pozitive në tretësirë, dhe lidhet me materialin me ngarkesë negative në qelizë, mbi të gjitha me acidet nukleike. Kromatina përqendron ADN-në në bërthamë, ndaj bërthama grumbullon më shumë ngjyrues. Citoplazma përmban ARN dhe molekula të tjera të ngarkuara, ndaj edhe ajo ngjyroset, por në mënyrë më të shpërndarë dhe më të zbehtë. Saktësimi kryesor: blu metileni nuk është ngjyrues specifik për ADN-në. Puna mbi shpërndarjen e blusë së metilenit në imazherinë e bërthamës qelizore përshkruan lidhjen e kationit me zona të pasura me acide nukleike, ndërsa një studim sasior më i hershëm mbi lidhjen e blusë së metilenit në preparate qelizore zbuloi se pjesa më e madhe e ngjyruesit të lidhur ishte e lidhur me acidet nukleike. Prandaj, një bërthamë e errët bashkë me një citoplazmë të çelët përbëjnë një model kontrasti, jo një analizë molekulare.

Gabimet që do të bëjnë nxënësit dhe si t’i interpretojnë

Pothuajse çdo preparat i pasuksesshëm i përket njërit prej pesë modeleve. Mësojuni nxënësve të identifikojnë problemin e preparatit në vend që ta përsërisin verbërisht.

Ngjyrosja e tepërt i bën qelizat dhe sfondin njëtrajtësisht të errët, kështu që bërthama humbet në fushën e pamjes. Korrigjojeni me një kohë më të shkurtër ngjyrosjeje ose me një shpëlarje më të plotë. Ngjyrosja e pamjaftueshme lë hije që zhduken kur shtohet drita; shtojeni kohën me intervale prej tridhjetë sekondash. Strishot e trasha prodhojnë masa të dendura të mbivendosura ku nuk mund të ndiqet asnjë kontur; korrigjimi është mekanik: herën tjetër shpërndajeni materialin në një shtresë më të hollë, sepse asnjë shpëlarje nuk shpëton një grumbull qelizash. Flluskat e ajrit shfaqen si rrathë të përsosur me buzë të errëta e të theksuara dhe ua tërheqin vëmendjen fillestarëve që i ngatërrojnë me struktura; rivendoseni lamelën ngadalë, në kënd. Pikat e vogla të errëta të shpërndara mbi ose rreth qelizave janë zakonisht baktere normale të gojës, siç vënë në dukje protokollet shkollore, për shembull procedura e Ingrid Science për qelizat e faqes. Ato vërtetojnë se goja është e banuar nga mikroorganizma, gjë që mund t’u mbetet në mendje nxënësve, por në këtë ushtrim nuk mund të identifikohen deri në nivelin e llojit dhe nuk duhen vizatuar si pjesë të qelizës. Mbetjet e ushqimit dhe fijet e mukusit ngjyrosen në mënyrë të çrregullt dhe të fortë; shpëlarja paraprake bëhet për t’i pakësuar ato.

Çfarë nuk mund të bëjë ky ushtrim

Ky është një vëzhgim mësimor, jo një test diagnostik. Asgjë në pamjen e qelizave në një ngjyrosje të kryer në klasë nuk mund të diagnostikojë infeksion, kancer ose ndonjë sëmundje tjetër, dhe artikulli nuk duhet lexuar sikur sugjeron të kundërtën. Preparati tregon formën, kufirin, citoplazmën dhe bërthamën në dy zmadhime. Nuk tregon ultrastrukturën e membranës, hollësitë e organeleve apo identitetin molekular. Shprehja e qartë e këtij kufizimi mbron si saktësinë shkencore, ashtu edhe nxënësit: një rezultat i mirë është një vizatim i etiketuar saktë, ku janë shënuar zmadhimi dhe ngjyruesi, jo një përfundim për shëndetin.

Fleta e punës për nxënësit dhe mikrografitë me etiketa

Dy materialet e projektit për këtë faqe janë mikrografia me etiketa më sipër dhe fleta e punës më poshtë. Shtypni nga një fletë pune për çdo nxënës ose shfaqeni me projektor dhe kërkojuni nxënësve t’i kopjojnë kutitë në fletore.

Si ta përdorni në një seancë 45-minutëshe: dhjetë minuta për udhëzimet e sigurisë dhe marrjen e mostrave, dhjetë minuta për ngjyrosjen dhe përgatitjen e preparatit, pesëmbëdhjetë minuta për vëzhgimin dhe skicimin në të dyja zmadhimet, dhjetë minuta për listën e kontrollit dhe krahasimin me mikrografinë me etiketa. Pikat e listës së kontrollit janë qëllimisht hapa praktikë. Strisho e hollë, kohë e saktë ngjyrosjeje, bërthamë më e errët se citoplazma, zmadhim i shënuar. Një nxënës që mund t’i shënojë të katra si të përmbushura e ka kuptuar konceptin që synon të mësojë ky mësim: mikroskopët shfaqin ndryshime dhe ngjyrosjet krijojnë ndryshimet që ia vlen të shfaqen.