Matja e specieve reaktive të oksigjenit në eksperimentet me blu metileni

Dy laboratorë kryejnë atë që secili e quan një eksperiment mbi veprimin antioksidues të blusë së metilenit. Njëri raporton se ngjyruesi pakëson speciet reaktive të oksigjenit. Tjetri raporton se i gjeneron ato. Të dy paraqesin kurba të qarta të përgjigjes ndaj dozës. Të dy janë të sinqertë. Dallimi nuk vjen nga mashtrimi apo paaftësia. Dy grupet kanë matur gjëra të ndryshme, në kushte të ndryshme ndriçimi, me sonda që u përgjigjen pyetjeve të ndryshme, dhe më pas i kanë përshkruar të dyja përgjigjet me të njëjtën fjalë: ROS.

Bluja e metilenit është një molekulë e vështirë për t'u matur me saktësi, sepse merr pjesë në kiminë që supozohet të vëzhgojë. Në errësirë, ajo transporton elektrone midis dhuruesve dhe pranuesve dhe kthehet në formën fillestare, e gatshme të përsërisë ciklin. Nën dritë, bëhet fotosensibilizues dhe arrin një gjendje triplete të eksituar, nga e cila mund t'i kalojë energji oksigjenit për të formuar oksigjen singlet ose të transferojë elektrone për të formuar radikale dhe peroksid hidrogjeni. Çdo sondë e vendosur në atë sistem mund të oksidohet, të reduktohet, të humbasë ngjyrën ose të maskohet optikisht nga vetë ngjyruesi. Prandaj, pyetja e parë për çdo rezultat matjeje të ROS nuk është kurrë sa është vlera. Është çfarë zbulon realisht analiza dhe çfarë ndikimi ka ngjyruesi mbi të.

Amplex Red: një analizë e kalibruar e peroksidit të hidrogjenit

Kombinimi blu metileni–Amplex Red është kombinimi më i justifikueshëm në këtë literaturë, kur përgatitet siç duhet. Kimia është specifike: peroksidaza e rrikës përdor peroksidin e hidrogjenit për të oksiduar substratin Amplex në një produkt fluoreshent, rezorufinë, me një stekiometri afërsisht një me një. Peroksidi nga mostra shndërrohet në fluoreshencë në detektor. Asgjë tjetër në familjen klasike të ROS nuk e nxit drejtpërdrejt atë reaksion.

Përparësia vendimtare është kalibrimi. Një studiues i kujdesshëm analizon standarde me përqendrime të njohura peroksidi në të njëjtin tampon, me të njëjtat përqendrime të peroksidazës dhe substratit, të njëjtën kohë inkubimi dhe të njëjtat parametra optikë, pastaj i lexon mostrat kundrejt asaj kurbe. Në studimin me mitokondri të izoluara të trurit, që shërben si bazë për këtë metodë, autorët bënë pikërisht këtë: shtuan sasi të njohura peroksidi në fund të çdo matjeje dhe i raportuan vlerat si shpejtësi në pikomole për minutë për miligram proteinë, jo si njësi arbitrare fluoreshence. Kjo është ajo që e kthen një shkëlqim në një matje.

Tri hollësi nga ai studim ia vlen të ndiqen. Së pari, autorët e verifikuan sinjalin me katalazë, e cila zbërthen peroksidin. Rritja e fluoreshencës e shkaktuar nga bluja e metilenit u ndal kur u shtua katalaza, duke konfirmuar se sinjali vinte nga peroksidi dhe jo nga një artefakt optik. Së dyti, ata e testuan drejtpërdrejt ndriçimin duke përdorur një grilë për rrezen e eksitimit, në mënyrë që mostrat të merrnin një të tetën e dozës normale të dritës, dhe sinjali u ul vetëm me nëntë për qind. Më shumë se nëntëdhjetë për qind e peroksidit që raportuan ishte i pavarur nga drita e përdorur për matje. Së treti, ata e matën veçmas eliminimin e peroksidit me një elektrodë dhe zbuluan se ngjyruesi njëkohësisht rriste prodhimin dhe ngadalësonte largimin e tij. Një sondë që raporton vetëm fluoreshencën neto do t'i kishte ngatërruar këto dy efekte.

Analiza gjithsesi ka mënyra në të cilat mund të dështojë, dhe bluja e metilenit prek disa prej tyre. Ngjyruesi përthith gjerësisht në të njëjtën zonë të kuqe ku emeton rezorufina, prandaj, në përqendrime të larta të ngjyruesit, mostra mund të maskojë sinjalin e vet përmes efekteve të filtrit të brendshëm. Për këtë arsye, standardet duhet të përmbajnë të njëjtin përqendrim ngjyruesi si mostrat. Amplex Red mund edhe të fotooksidohet vetvetiu, ndërsa produkti i tij, rezorufina, mund të hyjë në cikle fotoredoks që gjenerojnë superoksid dhe peroksid. Kjo ka rëndësi të madhe kur eksperimenti ndriçon edhe një fotosensibilizues. Zgjidhja praktike është që mostrat me blu metileni të rrezatohen fillimisht dhe më pas të analizohen alikuotat me reagentët Amplex në errësirë, në vend që ngjyruesi dhe sonda të ndriçohen së bashku. Së fundi, superoksid dismutaza nuk e pakëson domosdoshmërisht sinjalin e Amplex: shndërrimi i superoksidit në peroksid mund ta rrisë atë. Një kontroll me SOD që rrit fluoreshencën nuk ka dështuar. Ai ka identifikuar superoksidin si një specie pararendëse në rrugën e reaksionit.

DCFDA: një tregues jospecifik i oksidimit

Kombinimi blu metileni–DCFDA është burimi i pjesës më të madhe të paqartësisë. DCFH-DA është një pararendës që futet në qelizë. Esterazat brenda qelizës i heqin grupet e acetatit, duke lënë DCFH jofluoreshent, dhe oksidimi i DCFH jep DCF fluoreshent. Lista e substancave që e oksidojnë është e gjatë: radikalet hidroksil, ndërmjetësit e peroksidazës dhe hemit, dioksidi i azotit, acidi hipokloror dhe radikalet që rrjedhin nga peroksinitriti. Peroksidi i hidrogjenit i vetëm nuk e oksidon drejtpërdrejt me ndonjë shpejtësi të dobishme; fluoreshenca e varur nga peroksidi zakonisht kërkon praninë e hekurit, proteinave me hem ose reaksioneve të peroksidazës.

Kritika që duhet të citojë çdo seksion metodash vjen nga analiza e DCFH si sondë nga Kalyanaraman dhe kolegët, siç përmblidhet në studimin e mitokondrive të trurit që e hodhi poshtë DCFDA për këtë arsye. Ata treguan se sonda reagon ngadalë, me stekiometri të pakarakterizuar, pa kalibrim të vlefshëm dhe edhe me përbërje që nuk janë ROS. Sonda gjithashtu përforcon atë që mat: oksidimi i DCFH me një elektron prodhon një radikal DCF që reagon me oksigjenin për të formuar superoksid, i cili dismutohet duke dhënë peroksid shtesë. Procesi i matjes krijon pjesërisht vetë kiminë që raporton.

Asgjë nga kjo nuk e bën DCFDA të padobishme. E bën atë një mjet depistimi, jo identifikimi. Një rritje e fluoreshencës së DCF do të thotë se është rritur oksidimi i sondës i varur nga oksiduesit. Nuk do të thotë se është rritur peroksidi dhe sigurisht nuk do të thotë se është rritur sasia totale e ROS, një madhësi që nuk e mat asnjë sondë e vetme. Punimet e mëparshme me blu metileni, që mbështeteshin në oksidimin e DCF në përqendrime mbi një mikromolar, raportuan efekte prooksiduese, ndërsa sisteme të tjera në të njëjtën periudhë raportuan mbrojtje nga vdekja qelizore e shkaktuar nga peroksidi. Të dy vëzhgimet mund të jenë të vërteta për të njëjtin ngjyrues në kontekste të ndryshme redoks, dhe rezultati i DCF, i vetëm, nuk mund të tregojë se cili oksidues e shkaktoi sinjalin. Rëndësia e punimit të mëparshëm mbi mitokondritë e trurit qëndron te zëvendësimi i këtij depistimi me një matje të kalibruar të peroksidit dhe te konstatimi i drejtpërdrejtë i ngarkesës: edhe njëqind nanomolar ngjyrues e rriti disa herë çlirimin e peroksidit për çdo substrat dhe gjendje respiratore të testuar.

DCFDA ka edhe një kurth tjetër specifik për blunë e metilenit. Ngjyruesi ka ngjyrë të fortë dhe është aktiv në reaksionet redoks, kështu që mund të zbehë fluoreshencën, të shuajë emetimin ose të oksidojë përbërësit e sondës në mënyrë të pavarur nga ROS qelizore. Një kontroll pa qeliza, me ngjyrues dhe sondë, nuk është një shtesë zbukuruese fakultative. Është eksperimenti që tregon nëse ngjyruesi ndërvepron me sondën.

Kapja e spineve dhe konsumi i oksigjenit: identiteti dhe fluksi

Ndërsa sondat fluoreshente raportojnë se është shfaqur diçka e oksidueshme, rezonanca e spinit elektronik me kapës spini jep informacion më të afërt me identitetin e saj. Studimi klasik i fotokimisë së blusë së metilenit përdori ESR për të zbuluar radikalin e askorbatit nga ngjyruesi, askorbati dhe drita, më pas tregoi formimin e peroksidit në eksperimente të konsumit të oksigjenit dhe formimin e radikalit hidroksil të katalizuar nga hekuri në prova me kapje spini. Secila teknikë iu përgjigj pyetjes që të tjerat nuk mund ta zgjidhnin: ESR dha identitetin e radikalit, konsumi i oksigjenit dha fluksin e reaksionit në mënyrë të pavarur nga çdo sondë fluoreshente, dhe kombinimi tregoi se si rrugët e oksigjenit singlet, ashtu edhe ato të radikaleve, vepronin në të njëjtin sistem të ndriçuar.

Ai rezultat i vitit 1984 ende lexohet si një paralajmërim. Në prani të ndriçimit dhe të një agjenti reduktues, ngjyruesi gjeneroi peroksid, ndërsa në prani të hekurit sistemi prodhoi radikalin hidroksil, specien më reaktive të grupit. Autorët e lidhën këtë me askorbatin në sy dhe vunë në dyshim përdorimin pa kujdes në oftalmologji. Lexuesit e sotëm duhet të vënë re kushtet: dritë plus agjent reduktues plus hekur. Hiqni cilindo prej tyre dhe rruga dobësohet ose zhduket.

Elektrodat e oksigjenit e justifikojnë rolin e tyre në një mënyrë tjetër. Një elektrodë e tipit Clark mat konsumin neto të oksigjenit, duke vërtetuar se reaksionet redoks të nxitura nga ngjyruesi po konsumojnë oksigjen molekular dhe duke dhënë të dhëna kinetike që nuk mund t'i imitojë asnjë artefakt fluoreshence. Ajo nuk e identifikon produktin. Formimi i peroksidit, superoksidit dhe ujit, si edhe shuarja e oksigjenit singlet, të gjitha konsumojnë oksigjen. Fluksi pa identitet është po aq i paplotë sa identiteti pa fluks; për këtë arsye, punimet e forta e kombinojnë elektrodën me një analizë të kalibruar të peroksidit ose me një kapës spini.

Pse rezultatet për veprimin antioksidues bien ndesh

Vendosini tri llojet e rezultateve pranë njëri-tjetrit dhe kundërthëniet e dukshme në literaturën për blunë e metilenit shpjegohen nga dallimet metodologjike dhe tri fakte biologjike.

Së pari, ngjyruesi është njëkohësisht transportues elektronesh dhe burim peroksidi. Duke i devijuar elektronet nga vendet e frymëmarrjes ku oksigjeni përndryshe do të shndërrohej në superoksid, ai mund të ulë një specie ROS, ndërsa forma e tij e reduktuar e redukton oksigjenin drejtpërdrejt në peroksid, duke rritur një tjetër. Prandaj, një laborator që merret me kiminë redoks mitokondriale dhe rolin e blusë së metilenit si rrugë anashkaluese duhet të presë përgjigje që varen nga sonda: një sinjal i ndjeshëm ndaj superoksidit ulet, ndërsa sinjali i peroksidit rritet në të njëjtën kyvetë.

Së dyti, peroksidi në doza të ulëta është sinjal, jo vetëm burim dëmtimi. Studimi mbi mitokondritë e trurit të minjve që pasoi punimin e mëparshëm konstatoi gjenerim peroksidi edhe me vetëm pesëdhjetë nanomolar ngjyrues, pa lezione të ADN-së mitokondriale në nivele terapeutike, me mbrojtje kundër lezioneve të shkaktuara nga rotenoni pas paratrajtimit. Vetëm në njëqind mikromolar, shumë mbi intervalin terapeutik, ngjyruesi dëmtoi fragmente të caktuara të ADN-së, ndërsa drita e kuqe së bashku me njëzet mikromolar ngjyrues prodhoi oksigjen singlet që dëmtoi të gjitha fragmentet e testuara. Mekanizmi i propozuar është hormetik: prodhimi i lehtë i peroksidit aktivizon mbrojtjet antioksiduese të lidhura me Nrf2 dhe biogjenezën mitokondriale, kështu që një rezultat prooksidues afatshkurtër i paraprin një përfundimi antioksidues më afatgjatë. Një analizë e lexuar pas një ore dhe një analizë e lexuar pas një dite mund të mos përputhen, sepse biologjia ka ndryshuar ndërmjet tyre.

Së treti, drita përcakton edhe se cila molekulë është e pranishme. Ndriçimi e demetilon ngjyruesin drejt Azure B dhe produkteve të ngjashme, dhe llamba e mikroskopit mbi një pjatë laboratorike mjafton për të nxitur fotosensibilizimin e tij. Eksperimentet në errësirë dhe ato nën ndriçim janë eksperimente të ndryshme, dhe seksioni i kontrolleve për ndriçimin dhe trajtimin e ngjyruesit në çdo protokoll duhet t'i trajtojë si të tilla.

Një grup minimal kontrollesh dhe si të interpretohet çdo pretendim

Krahasimi më poshtë është materiali origjinal referues për këtë artikull. Përpara se të pranoni ndonjë rezultat të ROS me blu metileni, kontrolloni cilin rresht kanë plotësuar autorët dhe cilin kanë anashkaluar.

Prej kësaj rrjedh një rregull praktik interpretimi. Amplex me peroksidazë, i kalibruar dhe me kontroll me katalazë, jep prova për peroksidin. DCFDA jep prova për oksidimin jospecifik të sondës dhe asgjë më shumë. Kapja e spineve me kontrolle me kapës radikalesh jep prova për identitetin e radikalit. Konsumi i oksigjenit jep prova për fluksin. Një fjali që pretendon më shumë sesa mund të mbështesë analiza e saj, sado bindshëm të jetë shkruar, është një fjali për sondën, jo për ngjyruesin. Diskutimet e lidhura mbi varësinë nga doza dhe intervalin hormetik, rrjedhën e elektroneve në mitokondri, interferencën në analiza të mostrave të ngjyrosura dhe artefaktet e ndriçimit në mikroskopi e zgjerojnë secilën prej këtyre pikave, dhe secila mbetet e vlefshme pasi referenca e saj provizore të zëvendësohet.