Matja e efekteve mitokondriale të blusë së metilenit: oksigjeni, ATP-ja dhe potenciali i membranës

Supozoni se një laborator shton blu metileni në mitokondri me frymëmarrje të dëmtuar dhe vëren rritje të konsumit të oksigjenit. Fjalia që të vjen natyrshëm të shkruash është se ngjyruesi riktheu funksionin mitokondrial. Kjo fjali mund të jetë e gabuar. Fluksi i oksigjenit, sinteza e ATP-së dhe potenciali i membranës janë tre koncepte të dallueshme. Ato kanë të përbashkët të njëjtën organelë, ashtu si kopjeruajtja, sinkronizimi dhe ndarja me të tjerët kanë të përbashkët të njëjtën dosje në renë kompjuterike: janë të lidhura, por u nënshtrohen rregullave të ndryshme. Ngatërroni njërën me tjetrën dhe interpretimi dështon, edhe kur çdo matje është teknikisht e saktë.

Bluja e metilenit e bën këtë ngatërrim të mundshëm sepse merr pjesë në sistemin që mat. Ajo kryen cikle redoks, duke pranuar elektrone në pjesën e sipërme të zinxhirit dhe duke i dhuruar ato më tej; është një kation lipofil që grumbullohet në mitokondri të energjizuara dhe një përbërje me ngjyrë blu të theksuar që përthith dhe emeton dritë në të njëjtat breza si sondat e zakonshme. Një rezultat i vetëm matjeje nuk mund ta përballojë këtë ngarkesë. Qasja e besueshme, e treguar në studimet mitokondriale të Budapestit, është matja e fluksit të oksigjenit së bashku me shpejtësinë e sintezës së ATP-së, potencialin e membranës dhe çlirimin e peroksidit të hidrogjenit, me kontrolle specifike për ngjyruesin në çdo hap.

Respirometria mat fluksin e oksigjenit, jo prodhimin e energjisë

Respirometria me rezolucion të lartë, qoftë me Oroboros Oxygraph apo me analizuesin e fluksit jashtëqelizor Seahorse, raporton një gjë: sa shpejt po reduktohet oksigjeni. Ajo nuk raporton sa protone u pompuan për çdo elektron, sa gradient u ruajt apo nëse ATP-sintaza e përdori atë.

Terminologjia ka rëndësi. Në mitokondritë e izoluara, substrati pa ADP jep frymëmarrjen nga rrjedhja e protoneve, substrati me ADP në përqendrim ngopës jep kapacitetin e fosforilimit oksidativ dhe titrimi me shkëputës jep kapacitetin maksimal të transferimit të elektroneve. Në qelizat e paprekura, ekuivalentet në Seahorse janë frymëmarrja bazale, frymëmarrja e lidhur me ATP-në dhe e ndjeshme ndaj oligomicinës, rrjedhja e protoneve, frymëmarrja maksimale e përcaktuar me FCCP dhe konsumi jomitokondrial i oksigjenit që i reziston rotenonit së bashku me antimicinën. T’i quash rezultatet e Seahorse Gjendja 3 dhe Gjendja 4 nënkupton një saktësi që preparati nuk e mbështet, siç e sqaron kuadri i Agilent Mito Stress Test.

Bluja e metilenit e prish lidhjen intuitive mes më shumë oksigjeni dhe më shumë energjie. Në mitokondritë e izoluara nga truri i kavieve, ngjyruesi në përqendrime nga 100 nM deri në 1 uM rriti konsumin e oksigjenit në gjendje pushimi me substratet glutamat plus malat, sukcinat dhe alfa-glicerofosfat, me një rritje afërsisht 64 për qind me alfa-glicerofosfatin. Megjithatë, frymëmarrja e stimuluar nga ADP-ja në mitokondri të shëndetshme mbeti në thelb e pandryshuar, sipas studimit të mitokondrive të izoluara të trurit. Meqë frymëmarrja nga rrjedhja u rrit ndërsa fluksi i stimuluar nga ADP-ja mbeti i pandryshuar, raporti i llogaritur i kontrollit respirator bie. Kjo rënie nuk do të thotë se ngjyruesi i dëmtoi mitokondritë. Do të thotë se ngjyruesi shtoi një cikël redoks që konsumon oksigjen krahas frymëmarrjes normale. Një analizë e konsumit të oksigjenit me blu metileni që raporton vetëm rritjen ka matur kimi reale dhe nuk ka thënë asgjë për ruajtjen e energjisë.

Eksperimentet e rikthimit të funksionit tregojnë të njëjtin hendek në shkallë më të madhe. Kur Kompleksi I ishte i bllokuar, fluksi i oksigjenit u rikthye në afërsisht trefishin, ndërsa sinteza e ATP-së u rikthye vetëm në rreth 1.5-fishin. Më shumë oksigjen arriti te elektroda. Një pjesë më e vogël e tij shërbeu për prodhimin e ATP-së. Çdo pretendim për përmirësim të fosforilimit oksidativ kërkon edhe të dhënat e ATP-së, idealisht të shprehura si raport ATP për oksigjen, duke deklaruar konventën e përdorur për emëruesin.

Analizat e ATP-së matin shpejtësinë e sintezës, të cilën sasia e pranishme nuk mund ta zëvendësojë

Një analizë e ATP-së i përgjigjet një pyetjeje tjetër: sa ATP prodhohet për njësi kohe. Një matje kinetike, qoftë lumineshenca e luciferazës së xixëllonjës e ndjekur gjatë disa minutave apo një analizë e bashkërenduar me heksokinazë dhe glukozë-6-fosfat dehidrogjenazë e lexuar në 340 nm, jep një shpejtësi. Një matje e vetme e ATP-së totale në pikën përfundimtare jep sasinë e pranishme, e cila pasqyron sintezën minus konsumin dhe, më vete, tregon pak për fosforilimin oksidativ.

Grupi i Budapestit përdori metodën enzimatike të bashkërenduar me adenilat-kinazën të frenuar dhe gjeti se bluja e metilenit në 1 deri në 2 uM e rriti prodhimin e ATP-së në mënyrë modeste, por domethënëse, në mitokondri të trajtuara me rotenon dhe antimicinë. Ky është një rikthim i mirëfilltë i funksionit dhe është i pjesshëm. Studimi i toksicitetit të TEGDMA-së arriti në një rezultat të ngjashëm në një model tjetër: monomeri dentar TEGDMA në 5 mM e uli ndjeshëm frymëmarrjen e lidhur me Kompleksin I nga afërsisht 286 në 28 njësi fluksi dhe ngjyruesi në 2 uM e riktheu atë në afërsisht 86.

Dy kontrolle janë të domosdoshme me një përbërje me ngjyrë që merr pjesë në reaksionet redoks. Së pari, përdorni oligomicinë për të përcaktuar sa nga sinteza e matur e ATP-së varet nga ATP-sintaza. Së dyti, kryeni një provë rikuperimi të ATP-së së shtuar në një sistem pa qeliza, me një sasi të njohur ATP-je, reagentin e plotë dhe përqendrimet e sakta të ngjyruesit të përdorura, të paktën 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM dhe 2 uM. Ngjyruesi mund të përthithë dritën e emetuar, të frenojë enzimën raportuese ose të ndryshojë kiminë redoks të reagentit, dhe udhëzimet e përgjithshme për analizat me luciferazë rekomandojnë analiza biokimike kontrolluese pikërisht për këtë kategori ndërhyrjesh. Mos supozoni se 1 uM është pa artefakte vetëm sepse shuarja e sinjalit zakonisht është më e fortë në përqendrime më të larta.

Sondat e potencialit të membranës matin shpërndarjen e ngjyruesit, jo fluksin

Safranina O, TMRM dhe TMRE, rodamina 123 dhe JC-1 janë të gjitha katione që përshkojnë membranën. Ato grumbullohen në matricën me ngarkesë negative sipas ekuilibrit elektrokimik, kështu që fluorescenca e përgjithshme raporton potencialin tërthorazi, përmes vendndodhjes së sondës. Asnjëra prej tyre nuk mat ATP-në apo fluksin e elektroneve.

Secila sondë ka një preparat për të cilin përshtatet më mirë. Safranina O është e përshtatshme për mitokondri të izoluara dhe qeliza të permeabilizuara, zakonisht afër 2 uM, me eksitim afër 495 nm dhe emetim afër 585 nm, duke vepruar në një regjim shuarjeje ku marrja e saj ndryshon fluorescencën e përgjithshme. TMRM dhe TMRE janë të përshtatshme për qeliza të paprekura, me ngarkim në përqendrime të ulëta nanomolare dhe në modalitet pa shuarje, ku depolarizimi çliron ngjyruesin dhe fluorescenca mitokondriale bie; me ngarkim të lartë, drejtimi i sinjalit mund të përmbyset përmes vetëshuarjes. JC-1 jep një raport të përshtatshëm të gjelbër ndaj të kuqit, por varet nga ngarkimi dhe masa mitokondriale, gjë që e bën më pak të përshtatshme për punë sasiore sesa TMRM-ja e kontrolluar me kujdes. Këto kompromise përmblidhen në një rishikim të përdorur gjerësisht mbi sondat e potencialit të membranës mitokondriale.

Bluja e metilenit ndërhyn optikisht pikërisht në përqendrimet e përdorimit. Brezat e saj të përthithjes afër 600 deri në 665 nm mbivendosen me emetimin e kuq të sondave, ndaj efektet e filtrit të brendshëm, shuarja dhe përthithja e dritës së eksitimit janë të gjitha të mundshme. Ngjyruesi është gjithashtu një kation i dytë lipofil, shpërndarja e të cilit ndryshon me potencialin që po matet. Mbrojtja është përdorimi i matjeve të shumëfishta dhe kontrolleve bosh: vetëm sonda, vetëm ngjyruesi, sonda së bashku me secilin përqendrim të ngjyruesit, depolarizimi i plotë me FCCP si referencë zero dhe, idealisht, një sondë e dytë me veti optike të ndryshme. Studimi i anashkalimit të Kompleksit III e vendosi këtë precedent duke përsëritur matjen e rikthimit të potencialit të membranës si me safraninë O, ashtu edhe me TMRM, pas frenimit me antimicinë dhe miksotiazol, dhe duke marrë të njëjtin rikthim cilësor. Një raportues optik është një tregues. Dy raportues të pavarur janë dëshmi.

Tre preparate, tre pyetje të ndryshme

Mitokondritë e izoluara, qelizat e permeabilizuara dhe qelizat e paprekura nuk janë nivele të këmbyeshme ndjeshmërie të së njëjtës analizë. Ato janë koncepte të ndryshme me parime të ndryshme funksionimi.

Mitokondritë e izoluara ruajnë zinxhirin e transportit të elektroneve, membranën e brendshme dhe makinerinë e matricës, ndërsa hiqen membrana plazmatike, citosoli dhe arkitektura e rrjetit. Kjo heqje është vetë qëllimi: substratet, ADP-ja, frenuesit dhe përqendrimet e ngjyruesit përcaktohen saktësisht, që të mund të identifikohet një rrugë. Kostoja është humbja e furnizimit natyror me substrate, sinjalizimit dhe kërkesës për energji.

Qelizat e permeabilizuara i mbajnë mitokondritë brenda një pjese të madhe të arkitekturës së tyre qelizore, ndërsa lejojnë kalimin e substrateve ekzogjene dhe ADP-së përmes membranës plazmatike të hapur. Ato janë mjeti i duhur për të identifikuar një defekt në rrugën e përdorimit të një substrati brenda kontekstit qelizor. Permeabilizimi i tepruar dëmton membranën e jashtme dhe rregullimi citosolik humbet nga shpëlarja.

Qelizat e paprekura ruajnë gjithçka: pengesën e membranës plazmatike, agjentët reduktues citosolikë, transportin e substrateve endogjene, rrjetin mitokondrial dhe kërkesën për ATP. Ato janë më afër fiziologjisë dhe më larg mekanizmit, sepse marrja, reduktimi dhe sekuestrimi i ngjyruesit ndikojnë të gjitha në ekspozimin efektiv të mitokondrive.

Studimi i TEGDMA-së i përdori qëllimisht të tre nivelet: mitokondri të izoluara të trurit për rikthimin e oksidimit dhe potencialit nga ngjyruesi, qeliza staminale të permeabilizuara të pulpës dentare kryesisht për të lokalizuar dëmtimin te oksidimi i substrateve i lidhur me Kompleksin I dhe qeliza staminale të paprekura për efektin neto fiziologjik të ngjyruesit në 2 uM mbi konsumin e frenuar të oksigjenit. Për lexuesit që krahasojnë matjet mitokondriale mes preparateve, artikulli shpjegues shoqërues mbi mënyrën si bluja e metilenit lëviz elektronet nëpër zinxhirin respirator jep kontekstin e rrugëve, ndërsa udhëzuesi për leximin e studimeve të frymëmarrjes me blu metileni trajton logjikën e dozave dhe frenuesve.

Kontrollet që kërkon një ngjyrues aktiv në reaksionet redoks

Një përbërje që kryen cikle redoks kërkon një listë më të gjatë kontrollesh sesa një frenues i zakonshëm, sepse reaksionet kimike të vetë ngjyruesit mund të imitojnë proceset biologjike.

Për respirometrinë, përdorni një dhomë vetëm me tampon për të kontrolluar zhvendosjen e sinjalit, një dhomë me tampon dhe ngjyrues pa material biologjik, ngjyruesin së bashku me çdo agjent reduktues jashtëqelizor të pranishëm në analizë dhe, në fund, rotenon së bashku me antimicinë për të përcaktuar konsumin jomitokondrial të oksigjenit në qelizat e paprekura. Vini re se ngjyruesi i reduktuar rioksidohet duke transferuar elektrone te oksigjeni për të formuar peroksid hidrogjeni. Prandaj, një kontroll bosh vetëm me ngjyrues, pa një dhurues elektronesh, e nënvlerëson konsumin e oksigjenit pa qeliza që shfaqet sapo të jetë i disponueshëm NADH ose NADPH.

Për peroksidin e hidrogjenit, parapëlqeni Amplex UltraRed të kalibruar së bashku me peroksidazë të rrikës, në vend të ngjyruesve joselektivë DCFDA, verifikoni me katalazë dhe testoni varësinë nga ndriçimi, pasi ngjyruesi është fotosensibilizues. Studimi i mitokondrive të trurit gjeti se ngarkesa me peroksid u rrit më shumë se katërfish me vetëm 100 nM ngjyrues, ndërsa eliminimi u ngadalësua; peroksidi formohej drejtpërdrejt nga ngjyruesi i reduktuar, pa një ndërmjetës superoksid. Hollësitë e zgjedhjes së sondës dhe kontrolleve të dritës trajtohen në artikullin shoqërues mbi matjen e specieve reaktive të oksigjenit në eksperimente me ngjyrues, ndërsa pyetja më e gjerë se kur peroksidi vepron si sinjal dhe kur si ngarkesë trajtohet krahas ekuilibrit redoks qelizor dhe pretendimeve për antioksidantët.

Për pretendimet mbi rrugët, testoni të dy vendet e frenimit të Kompleksit III: antimicinën A në vendin Qi dhe miksotiazolin në vendin Qo, si dhe një pikë përfundimtare të Kompleksit IV me cianid. Një studim i mëparshëm i trurit të miut raportoi rikthim nga ngjyruesi të frymëmarrjes së bllokuar me rotenon, por jo të asaj të bllokuar me antimicinë, ndërsa studimi i mëvonshëm në tre specie gjeti rikthim të pjesshëm me të dy frenuesit dhe dëshmi të reduktimit të drejtpërdrejtë të citokromit c. Trajtojeni anashkalimin si të pajtueshëm me të dhënat më të reja, jo si të vërtetuar përfundimisht, sepse përqendrimi i ngjyruesit, vendi i veprimit të frenuesit, gjendja e substratit dhe shpërndarja e ngjyruesit e ndryshojnë të gjitha rrugën e vëzhguar.

Matrica e përzgjedhjes së analizës

Përdoreni këtë tabelë për ta zgjedhur matjen sipas pyetjes, jo anasjelltas.

Një pretendim minimalisht bindës kërkon përdorimin e të njëjtave përqendrime ngjyruesi, 100 nM, 300 nM, 1 uM dhe 2 uM, për matjen e fluksit të oksigjenit në kushtet e rrjedhjes së protoneve, ADP-së, oligomicinës dhe shkëputësit, të shpejtësisë së sintezës së ATP-së, të potencialit të membranës, mundësisht me dy sonda, dhe të çlirimit të kalibruar të peroksidit me katalazë dhe kontrolle pa qeliza. Raportoni grupin e lidhur të rezultateve: fluksin e oksigjenit plus shpejtësinë e prodhimit të ATP-së plus ATP për oksigjen plus potencialin plus peroksidin. Secili prej këtyre numrave, i marrë veçmas, është një matje në kërkim të një kuptimi.