Bluja e re e metilenit dhe ngjyrosja e retikulociteve: një ngjyrues i veçantë dhe një metodë me qeliza të gjalla

Një student përgatitet të numërojë retikulocitet, porosit blu metileni, e përzien me gjak dhe nuk sheh pothuajse asgjë. Një shok i kursit përdor një shishe me etiketën bluja e re e metilenit dhe sheh filamente blu të qarta brenda një pjese të qelizave të kuqe. Studenti i parë mendon se shishja e dytë është më e freskët ose më e përqendruar. Nuk është as njëra, as tjetra. Ajo përmban një molekulë tjetër.

Ky është gabimi konceptual që qëndron pas shumicës së ngatërresave në këtë fushë. Emri të lë të kuptosh se bluja e re e metilenit është një seri e përmirësuar e blusë së metilenit. Kimia tregon të kundërtën. Bluja e re e metilenit N është një ngjyrues fenotiazinik i veçantë, me numrin e vet në Colour Index, modelin e vet të zëvendësimit dhe rolin e vet të standardizuar në hematologji. Pasi ky dallim bëhet i qartë, pjesa tjetër e metodës (pse qelizat duhet të jenë të gjalla gjatë ngjyrosjes, çfarë quhet retikulocit, çfarë roli kanë trupëzat e Heinz-it dhe kur përdoret bluja brilante e krezilit) bëhet e lehtë për t’u kuptuar.

Përgjigjja e shkurtër

Bluja e re e metilenit N, reagenti hematologjik, zakonisht identifikohet si Basic Blue 24 në regjistrimin e PubChem për blunë e re të metilenit, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, me formulën C18H22ClN3S. Bluja e zakonshme e metilenit është kloruri i metiltioniniumit, Basic Blue 9, në regjistrimin e saj në PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, me formulën C16H18ClN3S. Nga ana strukturore, bluja e re e metilenit ka dy grupe metil në unazë dhe zinxhirë anësorë etilamino aty ku bluja e metilenit ka grupe dimetilamino. Ky dallim ndryshon sjelljen gjatë ngjyrosjes. Tekstet e hematologjisë e përshkruajnë blunë e zakonshme të metilenit si një ngjyrues relativisht të dobët për retikulocitet, ndërsa blunë e re të metilenit si më intensive dhe më uniforme; ky krahasim përmblidhet në temën e ScienceDirect për blunë e re të metilenit.

Po, bluja e re e metilenit është një ngjyrues supravital. Ngjyrosja supravitale nënkupton ngjyrosjen e qelizave të gjalla pas nxjerrjes nga trupi dhe përpara fiksimit, siç përkufizohet në përmbledhjen e NCBI për parimet e ngjyrosjes supravitale. Si bluja e re e metilenit, ashtu edhe bluja brilante e krezilit i përkasin kësaj kategorie, dhe standardi i CLSI për retikulocitet e përfshin shprehimisht blunë e re të metilenit si ngjyrues supravital. Studentët ndonjëherë e grupojnë këtë metodë me ngjyrosjen Romanowsky të strishove të fiksuara. Kjo mënyrë të menduari nuk funksionon këtu. Nëse fiksoni fillimisht, metoda pushon së funksionuari.

Për lexuesit që po ndjekin emra të ngjashëm ngjyruesish, blu metili kundrejt blusë së metilenit trajton një ngatërresë tjetër, më të madhe, mes një ngjyruesi anionik triarilmetanik dhe familjes kationike të fenotiazinave. Përmbledhja e ngjyrosjes laboratorike e vendos punën supravitale krahas metodave me strisho të fiksuara, ndërsa udhëzuesi për morfologjinë e qelizave të gjakut tregon ku përfshihet vlerësimi i retikulociteve në formulën leukocitare më të gjerë.

Një kujdes lidhur me katalogët: ekziston një formë tjetër e blusë së re të metilenit, si kripë e dyfishtë me klorur zinku, me CAS 6586-05-6. Prandaj, seksioni i metodave duhet të përcaktojë formën e kripës dhe furnizuesin, jo vetëm emrin e zakonshëm.

Çfarë bën realisht ngjyrosja supravitale

Retikulociti është një qelizë e kuqe e re që e ka humbur bërthamën, por ruan ARN ribozomale të mbetur. Në një preparat të njomë të pangjyrosur, kjo ARN është e padukshme. Ngjyruesi supravital hyn në qelizën e gjallë dhe e precipiton ose e grumbullon këtë ARN në granula dhe filamente blu, materialin retikulofilamentoz që shihet me imersion në vaj. Pra, rrjeti është produkt i ngjyrosjes, jo një skelet i formuar paraprakisht që pret të marrë ngjyrë. Kjo është arsyeja pse ndryshoret e protokollit (përqendrimi i ngjyruesit, tamponi, raporti gjak-ngjyrues, temperatura, koha) kanë po aq rëndësi sa emri i ngjyruesit.

Pasoja praktike është një rend i rreptë veprimesh: fillimisht përzieni gjakun e antikoaguluar me ngjyruesin, inkubojeni, pastaj përgatitni strishot dhe ekzaminojini të pafiksuara e pa kundërngjyrosje. Fiksimi përpara ngjyrosjes, ose një kundërngjyrosje që mbulon filamentet e zbehta, shkatërron informacionin nga i cili varet numërimi.

Një protokoll praktik për retikulocitet me blunë e re të metilenit

Nuk ka një formulim të vetëm universal, ndaj raportoni atë që është përdorur. Tri variante të dokumentuara tregojnë gamën e mundësive.

Procedura klasike e tipit Brecher përdor afërsisht 0.5 për qind blu të re metileni me oksalat kaliumi, të përzier në vëllime të barabarta me gjak me EDTA të përzier mirë, dhe të inkubuar rreth 10 deri në 15 minuta në temperaturë ambienti. Pas ripërzierjes së lehtë, përgatiten strisho të holla në formë pyke, thahen në ajër dhe ekzaminohen të pafiksuara me objektivin 100x me imersion në vaj. Procedura e NCBI për numërimin e retikulociteve përshkruan këtë rrjedhë pune dhe kornizën e numërimit që përdoret me të.

Varianti Dacie dhe Lewis përdor 1.0 për qind blu të re metileni në tretësirë fiziologjike me citrat, të përzier me 2 deri në 4 vëllime gjaku dhe të mbajtur në 37 C për 15 deri në 20 minuta përpara përgatitjes së strishove. Një zbatim i fundit i harmonizimit të procedurës CLSI H44 përdori një tretësirë më të holluar prej 0.1 për qind në tretësirë fiziologjike të tamponuar me fosfat në pH 7.4, me inkubim në 20 C për 10 minuta dhe pa fiksim, siç raportohet në studimin e harmonizimit të NMB të vitit 2026.

Rregullat e numërimit janë të përbashkëta për të gjitha variantet. Numërojeni një qelizë si retikulocit kur ajo përmban të paktën dy granula të dallueshme ose segmente filamentesh të ngjyrosura blu, duke përjashtuar kështu depozitimet e izoluara të ngjyruesit. Në punën rutinë, numëroni të paktën 1,000 qeliza të kuqe dhe raportoni retikulocitet si përqindje. Në përqindje të ulëta, statistika kërkon më shumë qeliza. Një përmbledhje e metodologjisë CLSI H44 vëren se, pranë 1 për qind retikulocite, nevojiten rreth 4,400 qeliza për ta ulur variacionin e numërimit në 5 për qind, në përmbledhjen e CLSI H44 në De Gruyter. Një disk okular Miller e bën praktik numërimin e një numri të madh qelizash. Filtroni ngjyruesin ose përgatiteni të freskët, sepse precipitati imiton inkluzionet granulare.

Trupëzat e Heinz-it në të njëjtin preparat

E njëjta strisho supravitale mund të tregojë edhe trupëzat e Heinz-it, të cilat janë grumbullime të hemoglobinës së oksiduar dhe të denatyruar, jo ARN e mbetur. Në preparatet me blunë e re të metilenit, ato shfaqen si trupëza të rrumbullakëta, shpesh të vetme dhe pranë membranës, me një ngjyrë blu më të çelët se materiali retikulofilamentoz. Ato nuk ruhen mirë gjatë fiksimit dhe kundërngjyrosjes, ndaj ekzaminoni strishon e pafiksuar. Një protokoll i fundit, që përdori 20 mikrolitra gjak me EDTA me 20 mikrolitra blu të re metileni 1 për qind dhe 15 minuta inkubim, përcaktoi numrin e qelizave pozitive për trupëza të Heinz-it mes 250 eritrociteve, në studimin në PMC që raporton këtë procedurë.

Dy dallime parandalojnë interpretimet e gabuara. Së pari, vjollca e metilit dhe vjollca kristal ngjyrosin trupëzat e Heinz-it më intensivisht se bluja e re e metilenit, siç vërehet në temën e ScienceDirect për trupëzat e Heinz-it. Bluja e re e metilenit është zgjedhja praktike kur retikulocitet dhe trupëzat e Heinz-it vlerësohen së bashku, por nuk është ngjyruesi më i fuqishëm i posaçëm për trupëzat e Heinz-it. Së dyti, inkluzionet HbH te bartësit e tiparit të alfa-talasemisë krijojnë pika të shumta të imëta në të gjithë qelizën pas ngjyrosjes supravitale, ndërsa trupëzat klasike të Heinz-it janë më të pakta, më të mëdha dhe shpesh të lidhura me membranën. Depozitimi i ngjyruesit është imituesi i tretë: ai ndodhet jashtë planit fokal të qelizave dhe ndryshon nga një fushë në tjetrën.

Bluja brilante e krezilit kundrejt blusë së re të metilenit

Të dy ngjyruesit janë supravitalë për retikulocitet, por standardizimi favorizon njërin prej tyre. Metoda CLSI H44-A2 për retikulocitet, e zhvilluar së bashku me Këshillin Ndërkombëtar për Standardizimin në Hematologji dhe e renditur në faqen e standardit CLSI H44, përcakton ngjyrosjen e gjakut me EDTA me blunë e re të metilenit si metodën krahasuese manuale. Mësimdhënia klasike e hematologjisë pajtohet për pamjen: bluja e re e metilenit jep ngjyrosje më intensive dhe më uniforme të filamenteve, ndërsa bluja brilante e krezilit ndryshon më shumë mes serive të prodhimit dhe mostrave.

Ky status kërkon një sqarim. Udhëzuesi i ICSH për vlerësimin e analizatorëve e pranon mikroskopinë manuale me blunë e re të metilenit si qasje krahasuese referimi, por e cilëson subjektive dhe relativisht të pasaktë, duke parapëlqyer procedurat e referimit me citometri rrjedhëse kur ato janë të disponueshme. Një krahasim i vitit 2022 me 100 mostra gjeti devijim sistematik më të ulët kundrejt analizatorit të përdorur me blunë brilante të krezilit sesa me blunë e re të metilenit, siç raportohet në krahasimin e metodave të ngjyrosjes në PMC. Përmbledhja e mbështetur për studentët është kjo: përdorni blunë e re të metilenit si krahasuesin manual të standardizuar, verifikoni çdo metodë vendore me blunë brilante të krezilit kundrejt saj ose kundrejt automatizimit dhe prisni shpërndarje më të gjerë të rezultateve nga mikroskopia manuale në të dyja rastet. Literatura më e hershme e standardizimit mbështeste gjithashtu Azure B të pastruar si një alternativë kimikisht më të pastër, sepse seritë e ngjyruesve tregtarë ndryshonin, në studimin e Marshall-it për Azure B, gjë që shpjegon pse shkalla e pastërtisë së reagentit ende përmendet në diskutimet e metodave.

Shmangia e gabimeve të zakonshme

Katër gabime shpjegojnë shumicën e preparateve të pasuksesshme. Porositja e blusë së zakonshme të metilenit në vend të blusë së re të metilenit N shkakton ngjyrosje të dobët për arsye kimike, jo teknike. Fiksimi ose kundërngjyrosja përpara ekzaminimit e heq sinjalin supravital. Numërimi i precipitatit të ngjyruesit si granula e rrit artificialisht rezultatin, gjë që parandalohet nga rregulli i dy granulave dhe ngjyruesi i filtruar. Numërimi i shumë pak qelizave kur përqindjet e retikulociteve janë të ulëta jep një numër që duket i saktë, por ka kufij të gjerë besimi. Çdo gabim ka të njëjtën shenjë dalluese: mikroskopisti fajëson mikroskopin për atë që është përcaktuar gjatë hapit me reagentin.