Artikull
Bluja e metilenit dhe oksidi nitrik: NOS, cGMP dhe sinjalizimi vaskular
Pyetja duket e thjeshtë: a e frenon bluja e metilenit oksidin nitrik? Në laborator, përgjigjja ndahet në katër pyetje të veçanta, dhe secila kërkon një test eksperimental të ndryshëm. Ngatërrimi i tyre është arsyeja kryesore pse shkrimet mbi blunë e metilenit dhe oksidin nitrik tingëllojnë të sigurta, por mbeten të paqarta.
Mendojeni sinjalin e oksidit nitrik si një zinxhir me katër hallka. Një gjen transkriptohet për të prodhuar sintazën e oksidit nitrik. Enzima e shndërron argininën në oksid nitrik. Gazi përhapet drejt objektivit të vet përpara se të reagojë me diçka tjetër. Guanilat-ciklaza e tretshme e zbulon atë dhe prodhon GMP ciklik. Për blunë e metilenit janë publikuar efekte në çdo hallkë, por provat vijnë nga preparate të ndryshme, përqendrime të ndryshme dhe izoforma të ndryshme. Një rezultat në një hallkë nuk provon veprim në një tjetër.
Zinxhiri kanonik, i shpjeguar qartë
Në murin e një ene gjaku, sekuenca standarde zhvillohet kështu. Një stimul vepron mbi një qelizë endoteliale. Sintaza endoteliale e oksidit nitrik, e quajtur eNOS ose NOS3, prodhon një impuls të vogël oksidi nitrik. Gazi përhapet në qelizën fqinje të muskulaturës së lëmuar, lidhet me hemin që përmban hekur të reduktuar të guanilat-ciklazës së tretshme dhe përshpejton shndërrimin e GTP në GMP ciklik. GMP ciklik aktivizon proteinë-kinazën G, ndryshon rregullimi i kalciumit dhe muskuli çlodhet.
Ekziston edhe një zinxhir i dytë që ia vlen të mbahet i veçuar. Gjatë infeksionit ose ekspozimit ndaj citokinave, qelizat transkriptojnë një enzimë tjetër, sintazën e induktueshme të oksidit nitrik ose iNOS, e quajtur edhe NOS2. Ajo prodhon flukse oksidi nitrik më të mëdha dhe më të qëndrueshme se eNOS. Një izoformë e tretë, NOS neuronale ose nNOS, i përket një konteksti tjetër. Kur një punim përmend sintazën e oksidit nitrik pa specifikuar izoformën, ndaloni dhe kontrolloni se cila është matur. Përmbledhja mbi mënyrën se si bluja e metilenit zhvendos elektronet thekson të njëjtën gjë për objektivat redoks në përgjithësi: ndërmjetësi nuk bën asgjë më vete, dhe partneri në secilin skaj përcakton rezultatin.
GMP ciklik i matur është gjithashtu një tregues i integruar, jo një analizë e drejtpërdrejtë e enzimës. Niveli i tij pasqyron sintezën nga ciklaza minus zbërthimin nga fosfodiesterazat, veçanërisht PDE5 në muskulaturën e lëmuar vaskulare. Prandaj, një rënie e GMP ciklik do të thotë se më pak sinjal arriti te detektori. Ajo nuk tregon vetvetiu se cila hallkë dështoi.
Hallka 1: prodhohet më pak enzimë iNOS
Në makrofagët e miut të stimuluar me lipopolisakarid bakterial, interferon gama ose të dyja, bluja e metilenit pengoi rritjen e pritshme të proteinës iNOS dhe uli fuqishëm ARN-në mesazhere të iNOS në eksperimentet mbi transkriptimin në makrofagë. Pjesa domethënëse është ajo që nuk ndryshoi. Zbërthimi i frenuesit I kappa B alpha, fosforilimi i NF kappa B dhe STAT1, si dhe zhvendosja e këtyre faktorëve në bërthamë mbetën kryesisht të paprekura. Ajo që u ul ishte lidhja e tyre me ADN-në, e konfirmuar nga imunoprecipitimi i kromatinës, i cili tregoi prani të reduktuar në promotorin e iNOS.
Ky është një efekt rregullator mbi gjenin, përpara përcaktimit të sasisë së enzimës, jo bllokim akut i një enzime ekzistuese. Ai i përket sinjalizimit inflamator, ku faktorët e transkriptimit duhet të lidhen me një promotor përpara se të shfaqet proteina. Nuk thotë asgjë të drejtpërdrejtë për eNOS konstitutive në një enë gjaku në gjendje qetësie, dhe duhet përshkruar në këto terma.
Hallka 2: enzima ekzistuese NOS punon më ngadalë
Një studim te minjtë e mëdhenj testoi një nivel tjetër. Minj meshkuj të vetëdijshëm morën lipopolisakarid në mënyrë intravenoze dhe, tre orë më vonë, morën ose tretësirë fiziologjike, ose blu metileni në sasinë 3 mg për kg në mënyrë intravenoze. Aktiviteti i sintazës së oksidit nitrik në hipotalamusin bazal medial u mat përmes shndërrimit të argininës së shënuar në citrulinë në studimin e aktivitetit të NOS në hipotalamus. Vetëm stresi së bashku me tretësirën fiziologjike induktuan njëfarë aktiviteti të pavarur nga kalciumi, ndërsa lipopolisakaridi e rriti atë në rreth dhjetë herë nivelin e kontrollit. Bluja e metilenit i eliminoi të dy komponentët e induktuar. Aktiviteti konstitutiv i varur nga kalciumi nuk ndryshoi në atë ind, në atë dozë dhe në atë pikë kohore.
Lexojeni këtë rezultat pikërisht siç është shkruar: u ul aktiviteti i matur i tipit iNOS në ato kushte. Kjo nuk është matje e shprehjes së gjeneve dhe nuk është provë e një selektiviteti të përhershëm për iNOS kundrejt eNOS ose nNOS. Puna me enzima të pastruara e bën edhe më të qartë nevojën për kujdes. Në analiza të drejtpërdrejta të sintazës së pastruar të oksidit nitrik, bluja e metilenit bllokoi plotësisht formimin e citrulinës në 30 micromolar, me një përqendrim për frenim të gjysmës afër 5.3 micromolar pa superoksid-dismutazë dhe 9.2 micromolar në praninë e saj, siç raportohet në krahasimin e NOS së pastruar me guanilat-ciklazën. Një studim i veçantë me nNOS të pastruar përfshiu oksidimin e hemit të lidhur me enzimën si mekanizëm. Mësimi praktik është se frenimi i drejtpërdrejtë i NOS është real në sisteme të izoluara, por rezultati nga hipotalamusi nuk mund të zgjerohet në një pretendim të përgjithshëm se bluja e metilenit nuk prek asnjë NOS konstitutive, kudo që ndodhet.
Hallka 3: oksidi nitrik humbet përpara se të mbërrijë
Demonstrimi më i qartë se një rënie e GMP ciklik mund të shpjegohet nga diçka tjetër përveç bllokimit të enzimës vjen nga qeliza të kultivuara të muskulaturës së lëmuar të arteries pulmonare të lepurit. Projekti eksperimental e anashkaloi plotësisht NOS endogjene duke shtuar drejtpërdrejt dhurues të oksidit nitrik, pastaj shqyrtoi nëse bluja e metilenit e ulte ende përgjigjen e GMP ciklik në studimin e superoksidit në muskulaturën e lëmuar vaskulare.
U testuan tre dhurues nga 1 deri në 100 micromolar: S nitrozo L cisteina, nitroprusidi i natriumit dhe një analog i qëndrueshëm i deaminuar i quajtur MPANO. Të gjithë e rritën GMP ciklik afërsisht nga 1.5 deri në 12 herë. Bluja e metilenit në 10 micromolar i frenoi dy të parët me 51 deri në 100 për qind dhe e la të pandryshuar përgjigjen ndaj MPANO. Nëse bluja e metilenit thjesht do të bllokonte vendin katalitik të ciklazës, ky selektivitet ndaj dhuruesve do të ishte i vështirë për t'u shpjeguar, sepse të tre përfundojnë te e njëjta enzimë më tej në zinxhir.
Më pas, tre kontrolle e lidhën mekanizmin me superoksidin. Së pari, gjenerimi i superoksidit jashtëqelizor me ksantinë dhe ksantinë-oksidazë riprodhoi të njëjtin model: CYSNO dhe nitroprusidi u bllokuan, ndërsa MPANO nuk u prek. Së dyti, bluja e metilenit shkaktoi prodhim superoksidi nga qelizat e muskulaturës së lëmuar, të varur nga doza dhe koha, i matur përmes reduktimit të citokromit c. Së treti, superoksid-dismutaza e parandaloi plotësisht frenimin, ndërsa katalaza jo, çka tregon superoksidin dhe jo peroksidin e hidrogjenit si specien kimike përgjegjëse drejtpërdrejt në atë preparat.
Versioni i eksperimentit me bashkëkulturë ia vlen të përshkruhet, sepse e lokalizon efektin në hapësirë. Qelizat endoteliale mbi lamela mbuluese u kultivuan për një kohë të shkurtër së bashku me qeliza të muskulaturës së lëmuar, kështu që faktori endotelial i çliruar në kushte bazale e rriti GMP ciklik të muskulaturës së lëmuar nga tre deri në tetë herë. Paratrajtimi i cilitdo prej dy kompartimenteve me blu metileni e uli atë sinjal, dhe superoksid-dismutaza e riktheu pjesërisht sinjalin pas paratrajtimit endotelial. Me fjalë të tjera, bluja e metilenit nuk ka pse të veprojë fare brenda qelizës së muskulaturës së lëmuar që shërben si detektor. Ajo mund ta ulë sinjalin duke larguar mesazherin gjatë rrugës. Udhëzuesi për leximin e kërkimeve mbi blunë e metilenit e trajton këtë si rregull të përgjithshëm: emërtoni kompartimentin ku ndodhi ndërhyrja përpara se të emërtoni një objektiv molekular.
Ta quaje këtë frenim të NOS do të ishte e gabuar. Që dhuruesit të vepronin, nuk kërkohej asnjë hap i ndërmjetësuar nga sintaza, e megjithatë sinjali u ul.
Hallka 4: vetë detektori përgjigjet më pak
Efektet e drejtpërdrejta mbi guanilat-ciklazën e tretshme ekzistojnë, por përqendrimet kanë rëndësi. Në krahasimin me enzima të pastruara të cituar më sipër, ciklaza e stimuluar nga oksidi nitrik kërkonte rreth 60 micromolar blu metileni për frenim të gjysmës, kundrejt frenimit të gjysmës së NOS afër 5 deri në 9 micromolar, dhe edhe 1 millimolar prodhoi një bllokim maksimal vetëm të pjesshëm. Ky është një dallim afërsisht gjashtë deri në njëmbëdhjetëfish. Prandaj, një eksperiment qelizor në përqendrime të ulëta micromolar që ul GMP ciklik nuk mund të quhet frenim selektiv i ciklazës vetëm mbi bazën e vlerës së GMP ciklik.
Një studim i mëvonshëm redoks shtoi një paralajmërim të dytë: bluja e metilenit e çaktivizoi ciklazën e aktivizuar nga oksidi nitrik përmes një mekanizmi të ndryshëm nga oksidimi i thjeshtë i hekurit të hemit nga ajri. Pra, detektori mund të dëmtohet funksionalisht, por kimia nuk është sqaruar përfundimisht, dhe hendeku mes përqendrimeve do të thotë se efektet e superoksidit dhe NOS duhen përjashtuar së pari në ekspozime me përqendrime të ulëta micromolar. Këtu hyn edhe kontrolli i fosfodiesterazës. Nëse zbërthimi nuk është matur ose bllokuar, grumbullimi i reduktuar i GMP ciklik është në përputhje me më pak sintezë, zbërthim më të shpejtë ose të dyja.
Pse kjo nuk përmblidhet në një pretendim të vetëm për presionin e gjakut
Çdo hallkë u vërtetua në një sistem të ndryshëm. Transkriptimi në makrofagë nuk është aktivitet enzimatik në hipotalamus. Aktiviteti hipotalamik pas lipopolisakaridit nuk është tonusi endotelial në gjendje qetësie. Faktori endotelial i çliruar në kushte bazale në bashkëkulturë nuk është vazodilatacion i stimuluar nga një agonist. Qelizat e kultivuara të arteries pulmonare në 10 micromolar blu metileni nuk janë qarkullimi i gjakut te njeriu. Përmbledhja e tyre në një pohim si «bluja e metilenit e rrit presionin e gjakut duke bllokuar oksidin nitrik» hedh poshtë pikërisht dallimet që kontrollet u projektuan të ruanin.
Tre kontrolle e mbajnë shpjegimin të saktë. Së pari, emërtoni izoformën: eNOS për tonusin vaskular në gjendje qetësie, iNOS për fluksin inflamator të induktuar, nNOS për kontekstet neuronale dhe disa kontekste me enzima të pastruara. Së dyti, emërtoni mënyrën si sigurohet sinjali i oksidit nitrik: sintezë endogjene, çlirim endotelial bazal ose një dhurues specifik si CYSNO, nitroprusidi apo MPANO, sepse dhuruesi i qëndrueshëm i rezistoi blusë së metilenit, ndërsa ata të paqëndrueshëm jo. Së treti, emërtoni përqendrimin dhe rikthimin e sinjalit: rikthimi nga superoksid-dismutaza tregon përfshirjen e superoksidit, dështimi i katalazës është argument kundër peroksidit të hidrogjenit në atë preparat, imitimi nga ksantinë-oksidaza tregon se ky mekanizëm është i mjaftueshëm, dhe analizat me enzima të pastruara i ndajnë efektet e drejtpërdrejta mbi katalizën nga humbjet gjatë rrugës.
Përmbledhja e shkurtër është kjo. Bluja e metilenit kuptohet më mirë si një agjent që ndërhyn në disa pika të sinjalizimit nga oksidi nitrik te GMP ciklik, sesa si një bllokues selektiv i ciklazës. Në varësi të preparatit dhe përqendrimit, ajo mund të reduktojë lidhjen e faktorëve të transkriptimit të iNOS, të frenojë drejtpërdrejt enzimat NOS, të ulë disponueshmërinë e oksidit nitrik përmes gjenerimit të superoksidit dhe të dëmtojë funksionin e ciklazës së aktivizuar nga oksidi nitrik. Roli i sinjalizimit me GMP ciklik në studimet vaskulare dhe krahasimi i dhuruesve të oksidit nitrik të përdorur në analizat qelizore trajtojnë secili më hollësisht një prej këtyre degëve, ndërsa metodat e përdorura për të ndarë efektet redoks nga efektet mbi enzimat shpjegojnë pse kombinimi i superoksid-dismutazës me katalazën dhe me një kontroll me dhurues të qëndrueshëm shfaqet kaq shpesh në këtë literaturë.
Një vlerë e ulët e GMP ciklik pas blusë së metilenit identifikon një zinxhir të këputur. Vetëm kontrollet tregojnë se cila hallkë u këput.