Bluja e metilenit dhe autofagjia: AMPK, mTOR dhe eksperimentet neuronale

Përfytyroni sikur kryeni një eksperiment qelizor, shtoni blunë e metilenit dhe shihni që një brez proteinik i quajtur LC3-II bëhet më i errët në membranën tuaj të imunoblotit. Është tunduese të njoftoni se përbërësi "nxit autofagjinë" dhe të vazhdoni më tej. Ky interpretim është i parakohshëm. Një brez më i errët LC3-II mund të nënkuptojë se qeliza po ndërton më shumë vezikula pastrimi, ose se vezikulat po grumbullohen sepse hapi i eliminimit është bllokuar. Dy interpretimet tregojnë drejtime të kundërta, dhe literatura neuronale mbi blunë e metilenit përmban shembuj provash të secilit lloj. Ky artikull shqyrton çfarë u mat realisht, analizë pas analize.

Makroautofagjia, forma e studiuar këtu, është procesi i riciklimit në masë të qelizës. Një qeskë membranore e quajtur fagofor zgjerohet rreth proteinave dhe organeleve të konsumuara, mbyllet duke formuar një autofagozom, bashkohet me një lizozom, dhe përmbajtja e saj degradohet e çlirohet për ripërdorim. Neuronet varen nga kjo rutinë sepse nuk ndahen dhe nuk mund të pakësojnë përqendrimin e pjesëve të dëmtuara përmes ndarjes. Kur riciklimi ngec, mbetjet grumbullohen. Kur ai funksionon, qeliza rimerr përbërës ndërtues në kushte stresi.

Çfarë tregoi një eksperiment hipokampal

Studimi kryesor i induktimit përdori qeliza hipokampale HT22 të miut, të stresuara nga privimi nga serumi për 24 orë, një gjendje që heq faktorët e rritjes dhe sinjalet trofike dhe shkakton si apoptozën, ashtu edhe autofagjinë. Studiuesit raportuan se bluja e metilenit e uli vdekjen qelizore në varësi të dozës dhe se kjo mbrojtje shoqërohej me shenja të makroautofagjisë.

Tabloja e shënuesve ishte specifike. Ngjyrosja e shpërndarë e LC3B u rishpërnda në pika perinukleare duke filluar rreth 20 nM blu metileni, me përgjigjen më të fortë të LC3-I dhe LC3-II pranë 1 μM. Si LC3B-I, ashtu edhe LC3B-II u rritën në varësi të dozës dhe kohës. Në mënyrë thelbësore, ekipi shkoi një hap përtej një imunobloti statik të LC3. Ata shtuan 10 μM klorokinë, e cila bllokon pastrimin lizozomal, dhe gjetën LC3-II më të lartë së bashku me p62 të stabilizuar në qelizat e trajtuara me blunë e metilenit. Ky model mbështet qarkullimin degradues të varur nga lizozomet, dhe jo thjesht një grumbullim. Ata treguan gjithashtu se klorokina e zhbëri pjesërisht efektin antiapoptotik, çka e lidh mbrojtjen me rrugën e autofagjisë dhe lizozomeve në këtë model.

Rezultati i sinjalizimit është pjesa që citohet më shpesh gabim. Sinjalizimi AMPK, i vlerësuar përmes AMPK së fosforiluar dhe objektivit të saj pasues, ACC së fosforiluar, u rrit në 12 dhe 24 orë në varësi të dozës. Frenuesi i AMPK, Compound C, i aplikuar në 20 μM gjatë 4 orëve të fundit, uli si fosforilimin e ACC, ashtu edhe aktivizimin e LC3. Përkundrazi, mTOR i fosforiluar nuk tregoi frenim të dallueshëm. Pra, në qelizat hipokampale të stresuara, gjetja ishte induktimi i lidhur me AMPK përmes një rruge në dukje të pavarur nga mTOR. I njëjti model u shfaq te minjtë e gjallë, ku trajtimi me blunë e metilenit induktoi shënues të makroautofagjisë në korteks dhe hipokamp.

Induktimi nuk është fluks i përfunduar

Këtu dallimi konceptual ka rëndësinë më të madhe. Induktimi nënkupton që mekanizmi në hapat fillestarë prodhon më shumë autofagozome. Fluksi nënkupton që përmbajtja përshkon të gjithë rrugën: izolimin, maturimin, bashkimin me lizozomin, degradimin, riciklimin. Çdo rritje e LC3-II është një pretendim për induktim derisa një test i fluksit të konfirmojë pjesën tjetër të rrugëtimit.

Testi standard i fluksit mat LC3-II me dhe pa një bllokim të shkurtër lizozomal, si ai me bafilomicinë A1 ose klorokinë. Nëse trajtimi vërtet e përshpejton prodhimin, bllokimi i shkatërrimit duhet ta rrisë edhe më tej LC3-II. Një reporter tandem mCherry-GFP-LC3 shton një këndvështrim të dytë: strukturat shkëlqejnë në të verdhë para bashkimit me lizozomin dhe vetëm në të kuqe pasi aciditeti shuan sinjalin GFP, kështu që më shumë pika vetëm të kuqe mbështesin përparimin drejt autolizozomeve acide. Ulja e proteinës p62 mund të përforcojë dëshmitë për qarkullimin degradues të përmbajtjes, me rezervën se vetë transkriptimi i p62 i përgjigjet stresit dhe duhet kontrolluar në nivelin e mRNA.

Lista e kontrollit më poshtë lidh çdo analizë të përdorur në këtë literaturë me atë që mat dhe atë që nuk mund të provojë e vetme. Lexuesit mund ta ripërdorin për çdo pretendim të ardhshëm mbi makroautofagjinë, përfshirë argumentet mbi agjërimin dhe jetëgjatësinë që mbështeten te këta shënues.

Vini re një grackë formulimi nga e cila ju mbron tabela. ACC e fosforiluar është forma e frenuar nga ana enzimatike. Rritja e saj dëshmon përgjigjen e AMPK, jo aktivizimin e ACC.

Shprehja "frenimi i makroautofagjisë e eliminoi neuroproteksionin" meriton të njëjtën saktësi. Në modelin HT22, ajo nënkupton se ndërhyrja në rrugën e autofagjisë dhe lizozomeve e hoqi avantazhin e mbijetesës që jepte bluja e metilenit gjatë privimit nga serumi. Ajo mbështet rolin e autofagjisë si të nevojshëm ose kontribues në atë kulturë qelizore. Nuk përcakton që autofagjia është mekanizmi i vetëm mbrojtës i përbërësit, nuk provon që klorokina vepron vetëm përmes autofagjisë, dhe do të nevojitej ndërhyrje gjenetike në ATG5, ATG7 ose ULK1 për ta forcuar pretendimin shkakësor.

Dy rrugë drejt të njëjtit mekanizëm

Një hartë e thjeshtuar ndihmon. Stresi energjetik rrit aktivitetin e AMPK, AMPK aktivizon kompleksin ULK1 dhe autofagjia fillon. Faktorët e rritjes dhe lëndët ushqyese rrisin aktivitetin e mTORC1, mTORC1 frenon ULK1 dhe autofagjia mbetet joaktive. Në hapat pas ULK1, kompleksi Beclin-1 dhe VPS34 nis formimin e fagoforit, LC3-I lipidohet duke u kthyer në LC3-II, autofagozomi mbyllet, bashkohet me lizozomin dhe përmbajtja degradohet, ndërsa p62 i nënshtrohet qarkullimit degradues.

Diagrami vendos çdo gjetje për blunë e metilenit në këtë hartë: rezultatin hipokampal pranë degës AMPK, rezultatin e qelizave pararendëse pranë degës mTOR.

Ky këndvështrim e zgjidh mospërputhjen e dukshme me studimin e dytë të Xie. Në qelizat pararendëse neurale të miut të madh në proliferim, një eksperiment më vete zbuloi se 5 μM blu metileni frenonte proliferimin dhe nxiste gjendjen e qetësisë qelizore, me ulje të qelizave pozitive për Ki67 në ditët 1 dhe 3, ndërsa diferencimi neuronal tashmë i përcaktuar mbetej i paprekur. Atje mekanizmi kalonte përmes frenimit të sinjalizimit mTOR: ulje e mTOR total dhe mTOR të fosforiluar krahas shprehjes më të ulët të p70S6K dhe 4EBP1, si dhe ulje e shprehjes së ciklinave E1, B1, D1 dhe D2. Fenotipi mbizotërues ishte gjendja e qetësisë së qelizave pararendëse, të cilën autorët e lidhën me vonimin e seneshencës, jo me shpëtimin e qelizave hipokampale të stresuara.

Nuk ka kundërshtim mes dy artikujve shkencorë. AMPK dhe mTOR janë integrues të ndjeshëm ndaj kontekstit, jo çelësa të pandryshueshëm. Një qelizë e stresuar, e ngjashme me një neuron, mund të angazhojë AMPK pa frenim të matshëm të mTOR, ndërsa një qelizë pararendëse e stimuluar nga mitogjenët mund t'i përgjigjet të njëjtit përbërës duke ngadalësuar mekanizmin e rritjes të varur nga mTOR. Lloji i qelizës, konteksti i stresit, përqendrimi dhe momenti i matjes përcaktojnë cila degë mbizotëron. Kjo është gjithashtu arsyeja pse efektet e blusë së metilenit mbi energjinë mitokondriale dhe proceset redoks bëjnë pjesë në të njëjtën tablo: siç përshkruan një përmbledhje mekanistike e neuroproteksionit, përbërësi vepron si bartës alternativ elektronesh, angazhon sinjalizimin antioksidues dhe antiapoptotik, frenon MAO dhe NOS dhe lidhet me rinovimin mitokondrial përmes biogjenezës dhe autofagjisë. Autofagjia është një degë e një profili pleiotropik, jo e gjithë historia.

Çfarë nuk tregojnë eksperimentet

Privimi nga serumi modelon stresin trofik dhe metabolik në një kulturë qelizore. Ai nuk modelon agjërimin e të gjithë organizmit: glukoza, aminoacidet dhe kripërat mbeten në mjedisin bazë të kulturës dhe nuk ekziston asnjë sjellje ushqyerjeje. Përqendrimet në kulturë nga 20 nM deri në 5 μM nuk mund të shndërrohen në doza për njerëzit me llogaritje aritmetike, sepse përthithja, lidhja me proteinat, gjendja redoks, metabolizmi, grumbullimi në inde dhe koha e ekspozimit ndryshojnë të gjitha.

Asnjë provë klinike te njerëzit nuk është projektuar për të dëshmuar fluksin autofagjik të induktuar nga bluja e metilenit te pacientët. Provat mekanistike mbeten në nivelin e studimeve qelizore, ex vivo dhe te kafshët, dhe përmbledhjet ende i përshkruajnë si paraprake provat për zbatimin klinik. Pra, këto studime nuk tregojnë se bluja e metilenit riprodhon agjërimin, zgjat jetën e njeriut përmes autofagjisë ose përfundon fluksin autofagjik në trurin e njeriut. Pretendimet për imitimin e agjërimit dhe jetëgjatësinë kërkojnë provat e tyre klinike, dhe provat klinike me blunë e metilenit te njerëzit për indikacione të tjera nuk bëhen prova të autofagjisë thjesht nga lidhja mes tyre. Kërkimet mbi modelet e stresit nga lëndët ushqyese dhe të jetëgjatësisë duhen lexuar duke mbajtur parasysh këtë kufi.

Për artikullin e ardhshëm shkencor që lexoni, zbatoni listën e kontrollit sipas radhës. Së pari, pyesni cila degë ndryshoi: AMPK, mTOR apo asnjëra. Pastaj pyesni nëse rezultati i LC3 u shoqërua me një test fluksi apo qëndron i vetëm. Më pas kontrolloni nëse bllokimi i rrugës e hoqi përfitimin dhe me çfarë metode. Një studim që u përgjigjet të tria pyetjeve ka fituar të drejtën për një pretendim të fortë mekanistik. Një studim që i përgjigjet vetëm të parës ka treguar një sinjal lejues, ndërsa pjesa tjetër e rrugëtimit mbetet e pahartuar.