Shpjegimi i ngjyruesve alkalinë dhe polikromë të blusë së metilenit sipas Loeffler

Tri shishe mund të qëndrojnë pranë njëra-tjetrës në një tavolinë ngjyrosjeje, secila e etiketuar me një variant të blusë së metilenit. Njëra thotë tretësirë ujore e blusë së metilenit 1%. Tjetra thotë blu alkaline e metilenit sipas Loeffler. E treta thotë blu polikrome e metilenit. Një punonjës i zënë merr atë që ka më afër. Strishoja pastaj ngjyroset tepër zbehtë, ose tepër njëtrajtësisht blu, ose në nuanca të papritura vjollcë, dhe faji për rezultatin i vihet mostrës.

Ky është problem i formulimit, jo i mostrës. Tri tretësirat përmbajnë ngjyrues të afërt, por mbështeten në koncepte të ndryshme ngjyrosjeje. Njëra është një ngjyrues i thjeshtë kationik në pH afër neutralit. Tjetra është i njëjti ngjyrues, të cilit alkali i shton fuqinë ngjyrosëse. E treta nuk është më fare një ngjyrues i vetëm, por një përzierje e oksiduar qëllimisht. Përdorni të gabuarën dhe parimi i ngjyrosjes ndryshon gjatë punës suaj.

Përgjigjja e shkurtër

Tretësira e thjeshtë ujore e blusë së metilenit është pika bazë: rreth 1% ngjyrues në ujë, një ngjyrues i thjeshtë kationik për morfologjinë bakteriale dhe mikroskopinë e përgjithshme. Bluja alkaline e metilenit sipas Loeffler shton një sasi të vogël, të matur, alkali të holluar në një tretësirë bazë alkoolike të holluar me ujë, gjë që rrit pH dhe nxit lidhjen më të fortë të ngjyruesit kationik me strukturat acide bakteriale. Bluja polikrome e metilenit është blu metileni që është maturuar qëllimisht përmes oksidimit në mjedis alkalin, prandaj shishja përmban një përzierje homologësh të demetiluar (azure A, azure B, azure C), tioninë dhe vjollcë metileni krahas blusë së mbetur të metilenit, dhe kjo përzierje ngjyros struktura të ndryshme me nuanca të ndryshme.

Nëse mbani mend vetëm një fjali: alkalinizimi ndryshon intensitetin e ngjyrosjes, ndërsa polikromizimi ndryshon ngjyrat e ngjyrosjes.

Tretësira e zakonshme ujore e blusë së metilenit: pika e referimit

Formulimi më i thjeshtë është blu metileni e tretur në ujë, zakonisht në 1% w/v, pa alkali dhe pa oksidim. Specia e ngjyrosur është kationi metiltioninium me një kundërjon klorur, një ngjyrues i vogël e i sheshtë i familjes së fenotiazinës, i përshkruar në regjistrimin e PubChem për blunë e metilenit si klorur metiltioniniumi. Si kation, ai lidhet me skeletet fosfatike të acideve nukleike dhe grupet acide në muret qelizore bakteriale, duke i ngjyrosur qelizat blu kundrejt një sfondi të çelët.

Përparësia e tij është parashikueshmëria. Bërthamat dhe bakteret shfaqen blu. Kontrasti është modest. Organizmat që dallohen me vështirësi mund të ngjyrosen dobët, dhe pikërisht këtë kufizim synoi të korrigjonte Loeffler. Për familjen më të gjerë të ngjyruesve të thjeshtë bakterialë, ku bën pjesë kjo tretësirë, shihni një përmbledhje të ngjyrosjes së thjeshtë bakteriale. Edhe këtu ka rëndësi verifikimi i identitetit: bluja e metilit është një molekulë krejt tjetër, siç shpjegon artikulli bluja e metilit kundrejt blusë së metilenit, prandaj një kërkim në katalog vetëm sipas emrit të ngjyrës mund të japë një klasë të gabuar ngjyruesish.

Bluja alkaline e metilenit sipas Loeffler: i njëjti ngjyrues, me veprim më të fortë

Receta klasike e Loeffler kombinon një tretësirë bazë alkoolike të blusë së metilenit me alkali të holluar në ujë. Versionet në tekstet mësimore kërkojnë 0.3 g ngjyrues në 30 mL etanol 95% plus 100 mL tretësirë ujore të hidroksidit të kaliumit 0.01% (ose, në mënyrë të barasvlershme, 30 mL tretësirë alkoolike të ngopur të blusë së metilenit, 100 mL ujë të distiluar dhe 1 mL KOH 1%), duke dhënë një tretësirë pune me rreth 0.3% ngjyrues në pH qartësisht alkalin. Versionet komerciale ndjekin të njëjtin parim, dhe katalogu i ngjyruesve mikrobiologjikë të Thermo Fisher e rendit blunë alkaline të metilenit sipas Loeffler krahas varianteve polikrome dhe ujore si artikuj të veçantë katalogu me përdorime të ndryshme të synuara.

Thelbi i veprimit është alkali. Rritja e pH deprotonon grupet karboksile dhe fosfatike në preparat, duke rritur dendësinë e vendeve me ngarkesë negative, ndërsa tretësira bazë me etanol e mban ngjyruesin plotësisht të tretur, në mënyrë që ai të arrijë në këto vende në formë monomerike. Rezultati është ngjyrosje më e shpejtë dhe më intensive e baktereve sesa me ngjyruesin ujor neutral, me bacilet dhe koket e njohura në blu të thellë të një strishoje bakteriologjike rutinë. Koha e ngjyrosjes është zakonisht një deri në tre minuta, e ndjekur nga shpëlarja me ujë.

Zbatimi klasik është Corynebacterium diphtheriae e kultivuar në mjedisin me serum të Loeffler: bacile të holla, shpesh në formë topuzi, me granula metakromatike Babes-Ernst të ngjyrosura fort, të përbëra nga polifosfat i depozituar. Lidhja mes mjedisit dhe ngjyruesit është historike, të dyja i atribuohen të njëjtit bakteriolog, dhe kontrasti i granulave është përfitimi diagnostik. Përtej punës me difterinë, ngjyruesi shërben si ngjyrues i përgjithshëm bakteriologjik për strisho nga kulturat, për morfologjinë e Neisseria në strisho klinike dhe kudo ku ngjyrosja Gram është e panevojshme, por bluja e thjeshtë ujore rezulton tepër e zbehtë. Është një ngjyrues monokrom. Çdo strukturë acide merr një nuancë të blusë. Kur një protokoll kërkon dallim përmes ngjyrave, vetëm alkali nuk mund ta sigurojë atë.

Një paralajmërim praktik: tretësirat alkaline të ngjyruesit degradohen dhe precipitojnë gjatë ruajtjes dhe përthithjes së dioksidit të karbonit. Laboratorët ose përgatisin vëllime të vogla, ose blejnë tretësirën e katalogut dhe respektojnë afatin e ruajtjes, në vend që të vazhdojnë të përdorin një shishe të vjetër që tashmë lëshon sediment mbi çdo lamë.

Bluja polikrome e metilenit: një emër, disa ngjyrues

Bluja polikrome e metilenit nis nga i njëjti ngjyrues, por e nënshtron atë ndaj oksidimit të kontrolluar në mjedis alkalin, proces i quajtur historikisht maturim ose polikromizim. Vjetrimi në mjedis alkalin, ngrohja me karbonat ose oksidimi me agjentë si dikromati heqin hap pas hapi grupet metil nga zëvendësuesit dimetilamino. Produkti është një përzierje: blu e mbetur e metilenit plus azure B (një metil i hequr), azure A dhe azure C (demetilim i mëtejshëm), tioninë (plotësisht e demetiluar) dhe nënprodukte oksiduese të familjes së vjollcës së metilenit. Çdo përbërës ka nuancën dhe afinitetin e vet për indet, prandaj përzierja ngjyros në mënyrë metakromatike: bërthamat, granulat, mucinat dhe kërci marrin secili tone të dallueshme nga blu deri në të kuqe-vjollcë.

Kjo kimi është e njëjta kimi që qëndron pas ngjyruesve të famshëm të gjakut. Studiuesit e hershëm zbuluan se bluja e alkalinizuar e metilenit i ngjyroste bërthamat e parazitit të malaries në nuanca vjollcë, por tretësirat e tyre ujore të maturuara ishin të paqëndrueshme dhe precipitonin brenda disa ditësh. Rishikimi mbi shpikjen e ngjyruesit vjollcë të gjakut përshkruan se si Malachowski dhe Romanowsky e shfrytëzuan në mënyrë të pavarur këtë efekt në 1891, se si u fut metanoli për të stabilizuar precipitatin e ngjyruesit dhe për të fiksuar strishot pa nxehtësi, dhe se si Giemsa më vonë e standardizoi përzierjen me sasi të matura të azure B dhe eozinës, me stabilizim nga gliceroli. Ngjyruesit modernë të tipit Giemsa rrjedhin drejtpërdrejt nga bluja polikrome e metilenit plus eozina, kombinimi që prodhon efektin Romanowsky. Për hollësi mbi kombinimin me eozinën dhe përbërësin azure B, shihni ngjyruesit e tipit Romanowsky dhe ndërveprimin mes azure B dhe eozinës.

Meqë është një përzierje, bluja polikrome e metilenit është, nga natyra, më pak e standardizuara nga të tria. Ekuilibri i saktë i nuancave të saj varet nga rruga dhe shkalla e oksidimit, prandaj furnizuesit e histologjisë e shesin si produkt të veçantë me testimin e vet të performancës, dhe jo si tretësirë të vjetruar të Loeffler. Përdorimet tipike përfshijnë evidentimin metakromatik të granulave të mastociteve, mucinave dhe kërcit, hollësitë e qelizave plazmatike dhe Helicobacter pylori në prerje indore me metoda polikrome të tipit Goodpasture. Është zgjedhja e duhur kur kërkohet diferencim përmes ngjyrës, dhe zgjedhja e gabuar kur protokolli pret një siluetë të qartë monokrome të baktereve.

Krahasimi i formulimit dhe qëllimit

Lexojeni tabelën si një udhëzues vendimmarrjeje. Nëse preparati ngjyroset tepër zbehtë, ndryshoni qasjen ndaj pH dhe zgjidhni ngjyruesin e Loeffler. Nëse gjithçka ngjyroset, por asgjë nuk dallohet nga pjesa tjetër, ndryshoni qasjen ndaj ngjyruesit dhe zgjidhni atë polikrom. Nëse një strisho e ngjyrosur me Loeffler i tregon granulat shumë qartë, por përgjegjësi pyet pse bërthamat dhe citoplazma kanë të njëjtën blu, përgjigjja është se asnjë ngjyrues alkalin monokrom nuk mund ta bëjë këtë dallim. Kjo kërkesë i përket familjes polikrome dhe derivateve të saj për ngjyrosjen e gjakut.

Shmangia e ngatërrimeve të zakonshme

Dy gabime shpjegojnë pjesën më të madhe të konfuzionit. I pari është trajtimi i ngjyruesit të Loeffler si i këmbyeshëm me blunë e thjeshtë të metilenit, sepse të dy duken blu në shishe. Ata ndryshojnë në pH dhe intensitet, dhe përdorimi i ngjyruesit neutral aty ku përcaktohet Loeffler humbet pikërisht kontrastin e granulave mbi të cilin është ndërtuar protokolli. I dyti është trajtimi i çdo bluje alkaline të vjetër ose të vjetruar aksidentalisht si polikrome. Vjetrimi i pakontrolluar prodhon një përzierje të panjohur me fuqi ngjyrosëse të panjohur, ndërsa tretësirat e mirëfillta polikrome përgatiten përmes rrugëve të përcaktuara të oksidimit dhe, në linjën e ngjyruesve të gjakut, kombinohen me sasi të matura eozine. Historia është udhëzuese këtu: tretësirat ujore të maturuara e të paqëndrueshme të viteve 1890 ua lanë vendin formulimeve metanolike të stabilizuara pikërisht sepse përzierjet e pakontrolluara nuk mund të riprodhoheshin, një mësim që ia vlen të kujtohet përpara se të ngjyroset një lamë diagnostike nga një shishe me vjetërsi të pasigurt.

Verifikimi i emrave e përmbyll këtë proces. Konfirmoni në etiketë artikullin e katalogut (ujor kundrejt Loeffler kundrejt polikromit), përmbajtjen e ngjyruesit dhe përdorimin e synuar, në vend që t'i deduktoni nga ngjyra. Tri formulimet ndajnë një kromofor prejardhës të përbashkët. Nuk ndajnë të njëjtin qëllim.