Zakaj se absorpcija metilenskega modrila spreminja s koncentracijo

Vzemite eno steklenico osnovne raztopine metilenskega modrila in napolnite dva kozarca. Prvega napolnite z osnovno raztopino, drugega pa z desetkrat razredčeno raztopino. Drugi kozarec je po pričakovanjih svetlejši. Poglejte pozorno in opazili boste še eno spremembo. Barvni odtenek se je spremenil. Ena raztopina se nagiba k čisti nebesno modri, druga pa k modri z vijoličnim pridihom. Redčenje ni zgolj zmanjšalo intenzivnosti. Spremenilo je, katera kemijska zvrst prispeva največ k absorpciji.

Razlaga tega premika je preprosta. Raztopljeno metilensko modrilo ni ena sama zvrst. Posamezen kation barvila, imenovan monomer, se lahko s ploskvijo naloži ob ploskev drugega kationa in tvori dimer, dimeri pa lahko prerastejo v večje agregate. Vsaka oblika ima svoj absorpcijski spekter. Spektrofotometer pokaže vsoto prispevkov zmesi, ki je v dani kiveti pri danih pogojih. Spremenite zmes in spekter se premakne, tudi kadar skupna vsebnost barvila sledi preprostemu razmerju redčenja.

Monomer in dimer absorbirata različno

Monomer si predstavljajte kot ploščato karto s pozitivnim nabojem, porazdeljenim po njenem obročnem sistemu. Dve takšni karti lahko ležita s ploskvama druga ob drugi. Pozitivna naboja se odbijata, vendar se ploščati aromatski površini privlačita z interakcijami zlaganja, okoliška voda in protiioni pa zaslanjajo odboj. Nastane vezan par s skupnimi elektronskimi stanji. Njegovi dovoljeni prehodi imajo višjo energijo kot prehod monomera, zato se pas dimera pojavi pri krajši valovni dolžini kot pas monomera, večji agregati pa prispevajo še bolj proti modremu delu spektra v obliki rame.

Pri zelo nizki koncentraciji v čisti vodi prevladujejo monomeri in z njimi pas pri daljši valovni dolžini. Z naraščanjem skupne koncentracije se delež parne oblike povečuje, pas pri krajši valovni dolžini pa raste glede na prvega. Razmerje obeh pasov zato kaže sestavo zmesi, ne pa neposredno skupne koncentracije. Meritev pri eni sami valovni dolžini ne more ločiti obeh oblik brez predpostavke o tem, katera oblika je prisotna.

Zato morajo biti referenčni spektri vedno navedeni skupaj s pogoji. Spektralna referenca za metilensko modrilo podaja položaje pasov skupaj s topilom, prisotnostjo soli, pH, temperaturo in koncentracijskim območjem, pri katerih so bili izmerjeni. Če navedete vrh brez teh pogojev, številka ni dovolj opredeljena. Dva laboratorija lahko pravilno poročata o različnih spektrih istega barvila, ker sta merila različni zmesi.

Kaj premika ravnotežje

Koncentracija je glavni dejavnik. Za nastanek dimera se morata srečati dva monomera, zato njegov delež narašča hitreje kot linearno glede na skupno količino barvila. Objavljene konstante dimerizacije v vodi so pri temperaturah blizu sobne reda več tisoč na molar, zato delež dimera v mikromolarnem območju strmo narašča. Obsežno skupno prilagajanje modela podatkom od mikromolarnih do milimolarnih koncentracij barvila je pokazalo neničeln prispevek tetramera že pod 34 mikromolar, kar opozarja, da pri desetinah mikromolar ni varno zaupati modelu s strogo dvema zvrstema. Natančni deleži so odvisni od medija, zato ta članek podaja smeri sprememb, ne univerzalne pretvorbene tabele.

Sol je drugi dejavnik. Raztopljeni ioni zaslanjajo odboj med dvema kationoma, zato dodani natrijev klorid in podobni elektroliti pri isti koncentraciji barvila premaknejo zmes proti dimerom in agregatom. Ta učinek je viden v raziskavah agregacije metilenskega modrila v slanih in vodnih medijih, kjer so merili barvilo pri koncentracijah od približno 1 mikromolar do 3.4 milimolar ob koncentracijah natrijevega klorida od 0 do 0.15 molar. Pri tem prilagajanju modela je delež tetramera pri kombinaciji visoke koncentracije barvila in visoke koncentracije soli dosegel približno 0.93. Spekter, posnet v vodi, in spekter, posnet v fiziološki raztopini, zato nista zamenljiva standarda.

Temperatura deluje v nasprotni smeri. Zlaganje sprošča vezano vodo, toplotno gibanje pa mu nasprotuje, zato segrevanje raztopine običajno povzroči disociacijo dela dimerov nazaj v monomere, medtem ko hlajenje spodbuja asociacijo. S prilagajanjem modela določena entalpija disociacije je negativna, približno minus 30 kilodžulov na mol v območju od 282 do 333 kelvinov, kar potrjuje eksotermno asociacijo. Hladen vzorec, izmerjen takoj po odvzemu iz hladilnika, je lahko videti bolj agregiran kot isti vzorec, izmerjen po vzpostavitvi ravnotežja pri sobni temperaturi.

Topilo določa izhodišče. Voda s svojim močnim hidrofobnim učinkom spodbuja zlaganje ploščatih kationov barvila. Alkoholi, kot sta etanol in metanol, bolje solvatirajo obroče in razbijajo agregate, zato je pri isti koncentraciji barvila v etanolu prisoten večji delež monomerov kot v vodi. Enako velja za aprotična sotopila: v zmeseh vode in DMSO pri 293 kelvinih je dodani DMSO zaviral dimerizacijo, kar kaže na strukturo vode kot gonilo zlaganja. Pri površinsko aktivnih snoveh je potrebna previdnost v obeh smereh. Nad njihovo kritično micelarno koncentracijo lahko micele solubilizirajo posamezne monomere in povrnejo spekter, podoben monomernemu. Pod to mejo pa lahko nasprotno nabita površinsko aktivna snov spodbuja zlaganje: pri 100 mikromolar barvila je polimerizacija, ki jo je povzročil SDS, dosegla vrh blizu 4 milimolar SDS, približno pri polovici kritične micelarne koncentracije, preden je pri višjih koncentracijah površinsko aktivne snovi prišlo do prerazporeditve. Raziskave vplivov topila in organiziranih medijev na spektre metilenskega modrila ponazarjajo, kako močno neposredno molekulsko okolje, ne le skupna koncentracija, določa opažene pasove.

pH je pomemben predvsem pri skrajnih vrednostih. V območju blizu nevtralnega pH, ki se uporablja pri večini laboratorijskega dela, metilensko modrilo ostaja v svoji značilni kationski modri obliki, pri spektralnih spremembah pa prevladuje agregacija. Močna kislina ali baza, redoks reakcije, ki tvorijo brezbarvno levko obliko, ter vezava na beljakovine in delce dodajo stanja zunaj para monomer–dimer. Kadar se spekter spremeni po dodatku pufra, preverite, ali pufer vsebuje soli in sestavine, ki omogočajo vezavo, preden vse pripišete zgolj pH. Referenčni pregled kemije in protonacije obravnava ta vprašanja identitete ločeno od vprašanja agregacije, obravnavanega tukaj.

Zakaj se premica Beer-Lambertovega zakona ukrivi

Beer-Lambertova zveza pravi, da je absorbanca enaka zmnožku absorptivnosti, koncentracije in dolžine optične poti. Gre za zakon štetja. Predpostavlja, da prešteti objekti ostajajo enaki, ko se njihovo število spreminja: ena absorbirajoča zvrst, nespremenljiv spekter, brez kemijskih sprememb zaradi koncentracije, monokromatska merilna svetloba, brez sipanja ali ponovnega oddajanja svetlobe ter svetloba, ki dejansko prepotuje navedeno pot.

Agregacija krši prvo predpostavko. Formalno skupna absorbanca ostaja vsota prispevkov posameznih zvrsti: dolžina optične poti, pomnožena z absorptivnostjo vsake zvrsti in njeno koncentracijo. Vsaka zvrst sledi zakonu. Zmes mu ne sledi, ker so koncentracije posameznih zvrsti nelinearne funkcije skupne koncentracije barvila. Umeritvena krivulja absorbance pri pasu monomera v odvisnosti od skupne koncentracije barvila je zato v meji razredčenih raztopin sprva ravna, z naraščanjem koncentracije pa se ukrivi navzdol, ker vsak dodani prirastek prinese sorazmerno manj monomera. Krivulja, odčitana pri pasu dimera, se ukrivi v nasprotno smer. Raziskave agregacije prav ta mehanizem prepoznavajo kot izvor opaženih odstopanj od Lambert-Beerovega zakona. Prilagajanje premice skozi ukrivljeno območje in njena ekstrapolacija sta pogosti napaki. Premica velja le znotraj območja in matrice, v katerih je bila določena.

Redčenje prinaša sorodno past. Redčenje koncentrirane osnovne raztopine v merilno območje instrumenta ne ohrani razmerja med zvrstmi. V razredčeni raztopini v kiveti se ravnotežje znova vzpostavi v smeri monomera, zato njen spekter pravilno opisuje razredčeni vzorec, ne pa osnovne raztopine. Preračunavanje spektra osnovne raztopine s sorazmernim povečevanjem absorbanc povrne oceno skupne vsebnosti le, če umeritev že upošteva ta premik. Nikoli pa ne povrne prvotne oblike pasov. Kdor primerja spekter koncentrata z razredčeno referenco, primerja dve različni zmesi.

Dolžina optične poti je del rezultata

Absorbanca je sorazmerna z razdaljo, ki jo svetloba prepotuje skozi vzorec. Kiveta z dolžino optične poti 10 mm daje desetkrat večjo absorbanco kot kiveta z dolžino optične poti 1 mm, ki vsebuje isto raztopino. Ta sorazmernost je natančna le za isto raztopino, zaradi agregacije pa je ta pogoj bistven.

V praksi je dolžina optične poti orodje za ohranjanje meritev znotraj veljavnega območja. Dolga pot omogoča občutljivost pri razredčenih, pretežno monomernih raztopinah. Kratka pot ohranja koncentriran vzorec znotraj merilnega območja brez obsežnega redčenja, ki bi na novo vzpostavilo ravnotežje. Raziskovalni program agregacije, iz katerega izhajajo zgornje številke, je uporabljal prav to: celice z dolžino optične poti 1 centimeter za barvilo od 1.1 do 34 mikromolar in celice z dolžino optične poti 0.01 centimetra za koncentracije od 94 mikromolar do 3.4 milimolar. Merilna podstavka za mikrovolumne in čitalniki mikrotitrskih plošč dodajajo svojo geometrijo s kratkimi in včasih spremenljivimi potmi ter površinami, na katere se lahko adsorbira kationsko barvilo. Dolžino poti navedite skupaj z izmerjeno vrednostjo, tako kot spektralna referenca navaja topilo in sol. Absorbanca brez dolžine optične poti ni rezultat. Je govorica.

Iz mehanizma izhaja merilna disciplina. Pred meritvijo vzorce uravnotežite pri isti temperaturi. Uporabljajte enak tip in usmerjenost kivet, ustrezne slepe vzorce z enako sestavo soli in pufra ter čisto laboratorijsko steklovino, saj se metilensko modrilo adsorbira na steklo in plastiko, obarvana kiveta pa ohrani sled zadnjega koncentriranega vzorca. Kadar je pomembna kinetika agregacije, merite kmalu po pripravi in vsako umeritveno krivuljo izdelajte v isti matrici ter pri isti dolžini optične poti kot neznane vzorce. Pri vizualnem preverjanju ne pozabite, da je oko slab spektrometer. Ali lahko barva raztopine potrdi čistost, je ločeno vprašanje z negativnim odgovorom, spremembe odtenka zaradi agregacije pa so eden od razlogov.

Diagram za ob instrument

Spodnja slika strne članek v en sam referenčni prikaz za laboratorijsko mizo. Tri raztopine vsebujejo isto barvilo, razlikujejo pa se po skupni koncentraciji in prisotnosti soli. Njihovi shematski spektri kažejo, kako pas monomera pri daljši valovni dolžini z vse večjim zlaganjem izgublja delež v prid pasu dimera pri krajši valovni dolžini. Pogoji so navedeni na sliki, ker brez njih krivulj ni mogoče ponovno uporabiti. Za izmerjene položaje pasov pri navedenih pogojih uporabite spektralno referenco. Za pojasnilo, kako barvilo po raztapljanju vstopa v celice, glejte vstop v celice z redukcijo in porazdeljevanjem. Za pojasnilo, kako svetlobna doza in geometrija dodatno oblikujeta fotokemijske meritve, glejte izpostavljenost svetlobi in merilno geometrijo.

Ključno pravilo ima dva dela. Spekter opredeli zmes, prisotno v kiveti pri navedenih pogojih. Le umeritev, izdelana pri istih pogojih, pretvori absorbanco v skupno koncentracijo.