Metilensko modrilo in vid: kaj kažejo raziskave mrežnice in kje so njihove meje

Bralec najde študijo, v kateri je metilensko modrilo zaščitilo mrežnico, nato pa si zastavi naravno vprašanje: ali bi ga bilo treba vnesti v oko? Raziskave o metilenskem modrilu in vidu na to vprašanje ne odgovarjajo, saj nobena od ključnih študij ni preizkusila takšne uporabe. V eni so barvilo skupaj s toksinom vbrizgali v steklovino miši. V drugi so ga dodali gojišču, ki je obdajalo izolirane celice v posodici. V tretji so ga dodali pitni vodi mutiranih miši. Vsak rezultat velja za svojo pot vnosa in svoj model.

Ta članek obravnava tri predklinične študije, dve vrsti celic mrežnice in mejo med laboratorijsko zaščito ter kliničnim zdravljenjem oči. Vzorec je dosleden: metilensko modrilo lahko v nadzorovanih pogojih spremeni mitohondrijski stres v celicah mrežnice, vendar ta ugotovitev ne upravičuje nanašanja maloprodajnih raztopin na oko.

Dve vrsti celic, dve različni bolezni

Mrežnica je sestavljena iz plasti in pomembno je, za katero plast gre. Svetloba najprej zadene fotoreceptorje v zunanjem delu mrežnice. Njihovi signali prek vmesnih nevronov potujejo do ganglijskih celic v notranjem delu mrežnice, katerih aksoni jo zapuščajo skozi vidni živec. Spodnji prikaz po vrsti poimenuje plasti.

Ganglijske celice mrežnice so celice, ki so ogrožene pri glavkomu in optični nevropatiji. Ko iskalne poizvedbe omenjajo metilensko modrilo in glavkom, običajno merijo na to notranjo plast in njene aksone. Fotoreceptorji pa so celice, ogrožene pri degeneraciji zunanjega dela mrežnice. V mrežnici imajo največje energijske potrebe in delujejo blizu svoje meje celičnega dihanja, zato jim ob odpovedi mitohondrijskega kompleksa I ostane malo rezerve. Rezultata pri eni vrsti celic ni mogoče prenesti na drugo, zato jih spodnje tri študije obravnavajo ločeno. Splošno veščino ločevanja modelov od sklepov pojasnjuje članek kako brati raziskave o metilenskem modrilu.

Ganglijske celice v živem mišjem očesu

V najzgodnejši od treh študij so raziskovalci modelirali optično nevropatijo z mikroinjiciranjem rotenona v steklovino enega mišjega očesa, drugo oko pa so uporabili kot kontrolo z nosilcem. Rotenon zavira mitohondrijski kompleks I, vstopno točko, ki prenaša elektrone iz NADH naprej. Motnja delovanja kompleksa I je tudi značilnost, ki ta model povezuje z Leberjevo dedno optično nevropatijo, boleznijo ganglijskih celic in vidnega živca.

Po štiriindvajsetih urah je bila plast ganglijskih celic v očeh, izpostavljenih rotenonu, tanjša in je vsebovala manj celic kot v kontrolnih očeh. Ko so metilensko modrilo vbrizgali sočasno z rotenonom, so to poškodbo preprečili v obsegu, odvisnem od odmerka; največji preizkušeni odmerek (0.07 mg/kg, daleč pod mišjim LD50) je ohranil tako debelino kot število celic. Vzporedni preizkusi v možganskih homogenatih so pokazali dva učinka: metilensko modrilo je odpravilo oksidativni stres, ki ga je povzročil rotenon, in upad porabe kisika. Avtorji so predlagali ekscitotoksični mehanizem, pri katerem rotenon poškoduje modulacijske amakrine celice, ganglijske celice se pretirano prožijo, antioksidativno delovanje pa prekine nastajajočo poškodbo. Predlagano kemijsko ozadje te zaščite je podrobneje opisano v članku mitohondrijski mehanizmi metilenskega modrila.

Ta rezultat ima tri omejitve. Barvilo so skupaj s toksinom vbrizgali neposredno v oko, kar je način vnosa, ne pa shema zdravljenja. Obdobje opazovanja je trajalo 24 ur. Poleg tega so se izmerjene vrednosti citokrom oksidaze povečale v obeh skupinah s poškodbo, kar so avtorji razumeli kot pretirano aktivnost, ne kot dokaz obnovljenega celičnega dihanja v živi mrežnici.

Ganglijske celice, izolirane v posodici

Druga študija je oko povsem izločila. Raziskovalci so iz mladih podgan izolirali primarne ganglijske celice mrežnice in jih izpostavili rotenonu, staurosporinu, ki sproža apoptozo, ali 72 uram pomanjkanja kisika, nato pa so preživetje izmerili z barvanjem za razlikovanje živih in mrtvih celic. Metilensko modrilo pri koncentracijah 1 in 10 mikromolarov v gojišču je izboljšalo preživetje ob vsakem od teh škodljivih vplivov, približno za faktor 1.5 do 1.9, odvisno od pogojev. Spremljevalni preizkus je pokazal, da je metilensko modrilo med izpostavljenostjo vodikovemu peroksidu ohranilo aktivnost citokrom c oksidaze.

To je farmakologija izoliranih celic. Spojina je do celic prišla z difuzijo skozi gojišče pri določeni koncentraciji, brez roženice, solznega filma, leče, steklovine, krvnega obtoka ali imunskega sistema na poti. Prav ta preprostost je namen modela: pokaže, da je mogoče zaščititi same ganglijske celice, ko spojina doseže te celice. Ničesar pa ne pove o tem, ali bi kapljica na površini roženice v notranji del mrežnice dostavila kakršno koli določeno koncentracijo. Koncentracijam nad 10 mikromolarov so se izognili zaradi toksičnosti za iste celice, kar opozarja, da lahko odziv na odmerek v posodici poteka v obe smeri.

Fotoreceptorji v mutiranih miših in celični liniji

Tretja študija obravnava zunanji del mrežnice. Raziskovalci so uporabili miši Harlequin, ki imajo pomanjkanje dejavnika, ki inducira apoptozo, zaradi česar kompleks I ostane nepopolno sestavljen, ter pri starosti 11 mesecev preučili zgradbo fotoreceptorjev, označevalce zunanjih segmentov in celovitost mitohondrijev. Metilensko modrilo so po odstavitvi dajali sistemsko s pitno vodo v količini približno 10 mg/kg na dan. Mutirane miši, ki so prejemale spojino, so ohranile večjo debelino mrežnice, več označevalcev rodopsina in opsina ter bolj zdravo zgradbo mitohondrijev kot mutirane miši, ki je niso prejemale.

Pri spremljevalnem delu s celicami so uporabili celice 661W, nesmrtno mišjo celično linijo, podobno fotoreceptorjem, ki so jo za 24 ur izpostavili rotenonu z metilenskim modrilom ali brez njega. Preživetje se je izboljšalo pri 30 mikromolarov, nižje koncentracije pa so normalizirale razmerje med NADH in NAD+ ter zmanjšale oksidativni stres. Izstopa podrobnost, česa metilensko modrilo ni naredilo: ni obnovilo ATP. Zaščita je bila povezana z zmanjšanjem redoks stresa in umiritvijo stresnih poti, vključno z mitohondrijskim odzivom na nepravilno zvite beljakovine in označevalci mitofagije, ne pa z obnovitvijo oskrbe z energijo.

Ta razlika je pomembna pri trditvah o metilenskem modrilu in mrežnici. Spojina lahko fotoreceptor pod stresom ohrani pri življenju, ne da bi odpravila njegov energijski primanjkljaj, zato je treba vsako razlago morebitnega terapevtskega učinka omejiti na redoks stres, ne pa na splošno pomlajevanje.

Primerjava treh študij

Spodnja primerjava vsako študijo opredeli glede na model in pot vnosa, saj ta dva stolpca določata, kaj lahko rezultat podpre.

Vsaka vrstica opisuje predklinično študijo. Nobena ni vključevala bolnikov, merila vida ali preizkušala oftalmične formulacije.

Zakaj to ni zdravljenje glavkoma

Zdravljenje glavkoma znižuje očesni tlak. Nevroprotekcija poskuša nekaj drugega: ohraniti ganglijske celice in njihove aksone pri življenju v stresnih razmerah. Zgornje študije sodijo v drugi sklop, ne v prvega. Nobena ni znižala tlaka in nobena ni primerjala metilenskega modrila z zdravljenjem za znižanje tlaka. Zato uveljavljeni pristopi k zdravljenju glavkoma in uravnavanju tlaka ostajajo ločeno vprašanje od redoks nevroprotekcije, rezultat o preživetju celic pa ne pomeni ohranjenega vida.

Razlike v poteh vnosa to še poudarijo. Sočasna injekcija v steklovino ob nastanku poškodbe vnese znano količino ob mrežnico. Dajanje s pitno vodo več mesecev izpostavlja celotno žival, pri čemer koncentracija v mrežnici ni znana. Gojišče neposredno izpostavi same celice. Nobena od teh poti ne napove, kolikšen delež lokalno nanesenega odmerka bi prešel roženico, se izognil odstranitvi s solzami, prešel lečo in steklovino ter dosegel eno od plasti mrežnice pri koristni koncentraciji. Ta težava z dostavo je del širšega vprašanja poti vnosa in porazdelitve metilenskega modrila, pri katerem vsaka pot zahteva svoje meritve koncentracije.

Razlike med tkivi pomenijo drugo oviro. Barvilo, ki doseže sprednji del očesa, še ni doseglo njegovega zadnjega dela, koncentracija, ki koristi eni plasti, pa lahko poškoduje drugo. Maloprodajne raztopine niso izdelane, sterilizirane, pufrane ali konzervirane kot oftalmični pripravki, pri izpostavljenosti roženice in notranjosti očesa pa so pomembni čistost, pH, osmolalnost in pomožne snovi. Nobena od teh ugotovitev o mrežnici ne potrjuje ustreznosti vnašanja takšnih raztopin v oko ali njihovega nanašanja nanj. Vprašanja o standardih priprave sodijo v okvir varnosti in ravnanja z metilenskim modrilom.

Kje se dokazi končajo

Skupaj ti trije članki podpirajo ozko trditev: v nadzorovanih pogojih lahko metilensko modrilo ublaži mitohondrijski redoks stres v nevronih mrežnice in ohrani njihovo zgradbo. Trditev se konča tam, kjer se končajo ti pogoji. Toksinski in genetski modeli kompleksa I niso glavkom, druze ali diabetična bolezen. Kratka obdobja opazovanja in strukturni končni izidi niso trajno ohranjen vid. Zaščitna koncentracija v enem predelku pa ni odmerek za drugega.

Za trdnejšo utemeljitev bi bili potrebni ločeni dokazi: opredeljena izpostavljenost mrežnice po klinično uporabni poti vnosa, končni izidi funkcije vida pri živalih, korist, neodvisna od tlaka, v modelu, relevantnem za glavkom, nato pa še podatki o varnosti in učinkovitosti pri ljudeh. Dokler teh dokazov ni, ostaja povezava med metilenskim modrilom in vidom raziskovalna hipoteza z jasnimi mejami: verjetna mitohondrijska farmakologija v mrežnici, dokazana le v celicah in živalih, brez poti od teh študij do zdravljenja oči.