Metilensko modrilo, tau in amiloid: zakaj se mehanizmi odstranjevanja beljakovin razlikujejo

Vprašajte, kaj metilensko modrilo naredi z beljakovinami, povezanimi z Alzheimerjevo boleznijo, in slišali boste en samozavesten odgovor tam, kjer bi morali slišati tri odgovore z jasnimi omejitvami. V epruveti ovira medsebojno povezovanje molekul tau. V enem mišjem modelu zniža raven topnega amiloida, medtem ko tau ostane nespremenjen. V drugem zmanjša delovanje encima, ki amiloid sploh proizvaja. Vse te ugotovitve so resnične. Nobena ne predstavlja celotne zgodbe in vse se ne pojavijo v isti živali ob istem času. Ta članek jih loči, da se rezultat enega poskusa ne bi več navajal kot dokaz za drugega.

Bralci, ki želijo širši pregled delovanja metilenskega modrila v celicah, naj začnejo tam. Bralci, ki želijo vedeti, ali je kaj od tega pomagalo bolnikom, naj preberejo pregled kliničnih raziskav pri Alzheimerjevi bolezni, kamor sodijo izidi preskušanj pri ljudeh. Ta članek tega pregleda ne ponavlja.

Ugotovitev o tau izhaja iz testov agregacije

Najstarejša od teh treh zgodb izhaja iz raziskav brez celic na tau, beljakovini, ki tvori nevrofibrilarne pentlje. V testu vezave tau-tau se fragmenti tau sestavljajo v parne vijačne filamente, fenotiazinska barvila, vključno z metilenskim modrilom, pa to sestavljanje zavirajo pri nizkih mikromolarnih koncentracijah. Poznejše biokemijske raziskave so ponudile kemično razlago: barvilo oksidira cisteinske ostanke v tau, kar stabilizira monomerno obliko in zavira nastajanje fibril, ki bi sicer rasle. Poročane zaviralne koncentracije za agregacijo tau segajo približno od enomestnih do nizkih dvomestnih mikromolarnih vrednosti, kar je pomembno za vse, kar sledi.

Bodite pozorni, za kakšno trditev gre. Ne pove ničesar o nastajanju tau, fosforilaciji tau v živih možganih ali odstranjevanju tau. Pove, da v določenih pogojih v epruveti oksidirano barvilo preprečuje zlaganje molekul tau. To je natančen, ozko opredeljen in uporaben rezultat. Težave se začnejo, ko ga razširimo v splošno trditev, da metilensko modrilo odstranjuje patološke spremembe tau, saj podatki iz poskusov na živalih te razlage ne podpirajo.

Ugotovitev o proteasomu izhaja iz miši 3xTg-AD in ločuje amiloid od tau

Poskus, ki najjasneje pokaže razhajanje med izidi, je 16-tedenska raziskava s krmo pri miših s tremi mutacijami, povezanimi z Alzheimerjevo boleznijo. Živali so od starosti šestih mesecev jedle krmo z metilenskim modrilom, raziskovalci pa so hkrati merili tri stvari: proteasom, ravni amiloida in tau.

Proteasom se je odzval. Kimotripsinu podobna aktivnost se je povečala za približno četrtino, tripsinu podobna aktivnost pa za približno polovico, medtem ko se tretja katalitična aktivnost ni pomembno spremenila. Ravni topnega amiloida beta 40 in 42 sta se vsaka znižali za približno četrtino. Avtorji so to razložili kot povečano odstranjevanje in ne zmanjšano nastajanje, ker se predhodniška beljakovina in fragmenti, ki nastanejo pri njeni obdelavi, niso spremenili, učenje in spomin pa sta se pri sondnem preizkusu v vodnem labirintu izboljšala.

Nato pa razhajanja. Netopni amiloid se ni spremenil. Obarvanje plakov se ni spremenilo. Skupna količina človeškega tau in fosforiliranega tau na treoninu 181 se ni spremenila, prav tako ne nepravilna lokalizacija tau. Tudi mitohondrijski kazalniki se niso spremenili: ni bilo pomembnega učinka na aktivnost citokrom c oksidaze, na količino beljakovine oksidaze ali na ATP. V tem modelu in pri tem režimu je torej metilensko modrilo povečalo dve od treh proteasomskih aktivnosti, znižalo raven topnega amiloida, izboljšalo vedenjski kazalnik, izide za tau, netopni amiloid in preverjene mitohondrijske izide pa pustilo nespremenjene.

En pridržek to poanto izostri, namesto da bi jo oslabil. Pri teh miših se v preučevani starosti agregati tau še niso razvili, zato poskus ne more pokazati, da metilensko modrilo ne deluje na pentlje tau. Pokaže pa, da se lahko raven topnega amiloida zniža, medtem ko merjeni izidi za tau ostanejo nespremenjeni. Prav takšen rezultat, pri katerem se ena beljakovina spremeni, druga pa ne, je za to temo pomemben. Če ste prišli sem v prepričanju, da aktivacija proteasoma z metilenskim modrilom hkrati odstranjuje obe značilni beljakovini, ta raziskava to predstavo popravlja.

Ugotovitev o nastajanju amiloida izhaja iz starih miši PSAPP in nasprotuje prejšnjemu mehanizmu

Druga raziskovalna skupina, drug model in nasprotna razlaga dogajanja pred nastankom amiloida. V trimesečni raziskavi z dajanjem po želodčni sondi pri 15-mesečnih miših PSAPP je dnevni peroralni odmerek 3 mg/kg zmanjšal obremenitev s plaki v različnih možganskih predelih za približno tretjino do polovico ter znižal ravni več amiloidnih frakcij, vključno z oligomeri, merjenimi z namenskim testom. Toda tu je bil predlagani mehanizem zmanjšano nastajanje, ne hitrejše odstranjevanje: v možganih se je zmanjšala količina beljakovine BACE1 in njenega produkta C99, raven informacijske RNA pa ne, kar kaže na učinek na ravni beljakovin in ne na zmanjšano izražanje genov.

Poskusi na celicah so to razlago dodatno podprli. V testu brez celic z rekombinantnim encimom je metilensko modrilo neposredno zaviralo BACE1, v celicah jajčnika hrčka, ki izražajo človeško predhodniško beljakovino amiloida, pa sta se ravni izločenega amiloida 40 in 42 znižali že pri koncentracijah 1.56 mikromolarja, medtem ko je predhodniška beljakovina ostala nespremenjena. Primerjajte to s prejšnjo raziskavo, kjer so fragmenti obdelave predhodniške beljakovine ostali nespremenjeni, učinek pa so pripisali odstranjevanju. Obe raziskavi ne moreta opisovati istega univerzalnega mehanizma, saj se modeli, starosti, odmerki, načini dajanja in trajanja razlikujejo. Prav to je bistvo. Učinki metilenskega modrila na amiloid v eni poskusni zasnovi potekajo prek nastajanja, v drugi pa prek odstranjevanja; navajanje katerega koli od teh učinkov brez opisa poskusne zasnove je zavajajoče.

Ena kemija, več tarč: povezava prek oksidacije cisteina

Tretja smer raziskav pojasnjuje, kako se lahko ista redoks kemija pojavi v nepovezanih zgodbah o beljakovinah. V biokemijski raziskavi zaviranja kaspaz je metilensko modrilo inaktiviralo kaspazo-6 tako, da je njen katalitični cistein oksidiralo v sulfensko kislino, kar so potrdili z masno spektrometrijo; koncentracija za polovični največji učinek je bila približno 10.6 mikromolarja. Kaspaza-3 je bila zavrta pri podobni koncentraciji. Avtorji so to izrecno povezali z literaturo o tau: ista kemija oksidacije cisteina, ki naj bi ohranjala tau v monomerni obliki, lahko onesposobi cisteinsko proteazo, učinkovite koncentracije pa se prekrivajo.

To je elegantna razlaga, hkrati pa tudi opozorilo. Redoks aktivna molekula, ki oksidira izpostavljene cisteine, bo pri vsaki koncentraciji, pri kateri deluje, imela več kot eno tarčo. Zgodba o razgradnji agregatov tau, zgodba o kaspazah in morda še druge imajo skupno kemično dejanje, vendar različne tarče. Zaradi tega skupnega dejanja ugotovitve niso medsebojno zamenljive. Pomeni pa, da odmerek in okoliščine določajo, katera tarča je pomembna, ter da lahko kronično odmerjanje, usmerjeno v en od cisteina odvisen proces, vpliva tudi na druge. Na to so avtorji raziskave o kaspazah neposredno opozorili. Povezana vprašanja o tem, kako redoks kemija metilenskega modrila izbira tarče, kaj aktivacija proteasoma pomeni za druge agregirane beljakovine in ali dolgotrajno odmerjanje spremeni profil tarč, si zaslužijo vsako svojo obravnavo.

Mehanizmi glede na izide: katera ugotovitev pripada kateremu modelu

Preberite tabelo vrstico za vrstico in nauk je jasen. Nobena vrstica ne kaže spremembe v vseh stolpcih. Najmočnejši rezultat glede nastajanja amiloida izhaja iz raziskave, ki proteasoma sploh ni preverjala. Najmočnejši rezultat glede proteasoma izhaja iz raziskave, v kateri se obdelava predhodniške beljakovine ni spremenila. Ugotovitev o tau izvira predvsem iz epruvet in iz kemije, skupne tudi encimom, ki niso predvidene tarče. Kdor te stolpce združi v eno trditev, da metilensko modrilo odstranjuje patološke beljakovine kot skupino, piše pregled poskusa, ki ni bil nikoli izveden.

Ta doslednost velja tudi za bolnike. Ali se ti mehanizmi skupaj odrazijo v klinični koristi, je ločeno vprašanje z lastnimi preskušanji in ugotovitvami. Odgovor nanj je v kliničnih dokazih pri Alzheimerjevi bolezni, ne tukaj.