Metilensko modrilo in staranje okostja: zakaj ugotovitve na celicah niso napovedale izidov za kosti pri miših

Predstavljajte si spojino, ki zavira prav tiste celice, ki razgrajujejo kost, in v poskusu v laboratorijski posodici deluje natanko tako, kot smo upali. Manj večjedrnih osteoklastov, jasna odvisnost odziva od odmerka in verjetna mitohondrijska razlaga v ozadju. Nato isto spojino dajemo mišim večino njihovega odraslega življenja, njihova okostja posnamemo v treh dimenzijah in ne opazimo nobene razlike. Stare kosti so videti stare, ne glede na obravnavo.

To je pošten povzetek ene od raziskav iz leta 2024. Vredno jo je natančno razumeti, saj se dotika prav tiste prelomnice, na kateri se večina trditev o prehranskih dopolnilih za kosti sesuje. Gre za članek Poudela in sodelavcev, objavljen v reviji Aging marca 2024. Članek je prosto dostopen, zato lahko vsako spodaj navedeno meritev preverite v viru. Njegova glavna ugotovitev je ničelni rezultat. Ničelni rezultati niso neuspehi. So odgovori in ta dobro odgovori na ozko vprašanje: ali dolgotrajna sistemska antioksidativna obravnava z metilenskim modrilom ali mitokinonom ohranja starajoče se mišje okostje? Ne.

Kako je staranje kosti videti v številkah

Izguba kostnine s starostjo ni en sam pojav, zato raziskava ni merila le ene stvari. Raziskovalci so z mikroračunalniško tomografijo posneli tri mesta v okostju: kortikalno kost na sredini diafize stegnenice (gostega osrednjega dela), trabekularno kost v distalni metafizi stegnenice (gobaste mreže blizu sklepa) in trabekularno kost v petem ledvenem vretencu. Na vsakem mestu so zabeležili standardne parametre mikroarhitekture. BV/TV je delež prostornine, ki ga zaseda kostnina in ne prostor kostnega mozga. BMD je mineralna gostota. Tb.Th, Tb.N in Tb.Sp opisujejo debelino, število in razmik trabekul. Debelina kortikalne kosti in površine prečnih prerezov opisujejo osrednji del kosti.

Trabekularno kost si predstavljajte kot nosilno ogrodje v skladišču. Staranje nekatere opornike povsem odstrani, preostale pa stanjša, zato se delež prostora, ki ga zapolnjuje ogrodje, zmanjša, preostali oporniki so bolj narazen in celotno ogrodje prenese manjšo obremenitev. Kortikalna kost je sama stena skladišča, ki postaja vse tanjša. Obravnava, ki varuje okostje, bi se morala odraziti v teh številkah. Prav to je raziskava preverjala.

Kaj se je zgodilo v laboratorijski posodici

Pri celičnih poskusih so uporabili kostni mozeg iz stegnenic in golenic 6 do 7 mesecev starih miši UM-HET3, genetsko raznolikega seva, vzrejenega za raziskave staranja. Dobili so štiri ugotovitve, ki kažejo v različne smeri, zato vsaka potrebuje svojo razlago.

Prvič, mezenhimske matične celice, med katerimi so tudi bodoče celice, ki tvorijo kost, so v 48 urah ostale viabilne pri koncentracijah metilenskega modrila in mitokinona od 0.125 do 0.5 mikromolarno. Brez toksičnosti in brez izboljšanja. Drugič, ko so te matične celice v osteogenem gojišču spodbudili k razvoju v osteoblaste in jih 18. dan obarvali za alkalno fosfatazo, nobena spojina ni spremenila izida pri nobeni preizkušeni koncentraciji. Del kulture, ki tvori kost, se ni odzval.

Tretjič, del, ki razgrajuje kost, pa se je odzval. Predhodniške celice iz kostnega mozga, spodbujene z M-CSF in RANKL, standardno kombinacijo za nastajanje osteoklastov, so z naraščanjem koncentracije tvorile manj TRAP-pozitivnih večjedrnih celic. Jasno zmanjšanje se je pojavilo nad 0.25 mikromolarno, v praksi pri najvišji preizkušeni koncentraciji 0.5. To je ugotovitev, iz katere nastanejo nešteti optimistični povzetki, in v okviru svojih meja je resnična: neposredna, neprekinjena izpostavljenost v kulturi je zavirala nastajanje osteoklastov na način, odvisen od odmerka.

Četrtič, pri zrelih osteoblastih, ki so bili izpostavljeni 48 ur in nato vključeni v test mitohondrijskega stresa, nobena spojina ni povzročila statistično značilne spremembe bazalne ali maksimalne porabe kisika. Pri koncentraciji 0.5 mikromolarno sta obe nekoliko zmanjšali celično dihanje, vendar sprememba ni dosegla statistične značilnosti. Tako v posodici ni bilo izboljšanja mitohondrijskega delovanja v celicah, ki tvorijo kost, ki bi ga lahko postavili ob bok učinku na osteoklaste. Predlagani mehanizem, izboljšanje energijske presnove prek mitohondrijske verige za prenos elektronov, ni prinesel merljivega povečanja celičnega dihanja tam, kjer so ga raziskovalci iskali.

Kaj se je zgodilo pri miših

Sledila sta dva poskusa na živalih, zelo različna po obsegu.

V manjšem so uporabili samice inbridiranega seva C57BL/6J, enega najpogosteje uporabljenih sevov v biomedicinskih raziskavah. Od starosti 18 mesecev, kar pri miši približno ustreza poznemu srednjemu življenjskemu obdobju, je polovica pila vodo z metilenskim modrilom v koncentraciji 250 mikromolarno 6 ali 12 mesecev, torej do starosti 24 ali 30 mesecev. Neobravnavane 18-mesečne samice so zagotovile izhodiščne vrednosti, 5-mesečne samice pa so pokazale, kakšna je mlada kost. Staranje je naredilo natanko to, kar običajno naredi. V vretencu L5 se je prostorninski delež kostnine zmanjšal za približno 35 odstotkov, mineralna gostota za približno 18 odstotkov, število trabekul pa se je približno prepolovilo, ne glede na obravnavo. Debelina kortikalne kosti se je med 18. in 24. mesecem zmanjšala za približno 10 odstotkov, do 30. meseca pa za približno 30 odstotkov. Metilensko modrilo ni spremenilo nobene od teh krivulj.

Večji poskus je potekal v okviru programa Interventions Testing Program pri National Institute on Aging, ki na treh lokacijah preizkuša potencialno uporabne spojine pri miših UM-HET3 obeh spolov. Metilensko modrilo v koncentraciji 28 delov na milijon v hrani in mitokinon v koncentraciji 100 delov na milijon so začeli dajati v zgodnji odraslosti in nadaljevali do starosti približno 22 do 24 mesecev. Ista tri mesta v okostju so pregledali z mikro-CT. Objavljena tabela navaja vsak parameter po spolu in obravnavi s prilagojenimi statističnimi analizami, stolpec za obravnavo pa povsod kaže enako: nobenega statistično značilnega učinka in nobene interakcije med obravnavo in spolom, nikjer. Kortikalna ali trabekularna kost, stegnenica ali hrbtenica, samec ali samica, metilensko modrilo ali mitokinon. Okostje se je staralo po običajnem poteku.

Primerjalna tabela, ki povezuje oba dela

To je ključni prikaz, na katerem temelji celoten članek. Vsaka vrstica povezuje ugotovitev iz posodice z ugotovitvijo pri živali za isti biološki proces, pri čemer uporablja meritve iz same raziskave.

Če tabelo beremo vrstico za vrstico, paradoks izgine. Od štirih celičnih procesov se je odzval le eden, pa še ta le blizu zgornje meje preizkušenega razpona ob neprekinjeni neposredni izpostavljenosti. Vse drugo v posodici je že pokazalo ničelni rezultat. Rezultat pri živalih je zato manj podoben protislovju in bolj potrditvi: trije ničelni rezultati in en pogojni učinek v kulturi so pri živali postali ničelni rezultat na vseh področjih.

Zgradba kosti ni življenjska doba

Eno napačno razumevanje si zasluži svoj razdelek, saj za metilensko modrilo obstajajo podatki o življenjski dobi, ki jih je lahko zmotno razumeti kot podatke o kosteh. V prejšnji kohorti programa Interventions Testing Program je metilensko modrilo pri istem odmerku v prehrani povečalo 90. percentil življenjske dobe samic UM-HET3 za približno 6 odstotkov. Šlo je za učinek na preživetje v poznem življenjskem obdobju brez spremembe mediane življenjske dobe in brez učinka pri samcih. Mitokinon ni pokazal učinka na življenjsko dobo pri nobenem spolu. Ti podatki o preživetju izvirajo iz objavljenih podatkov programa o dolgoživosti, ne iz članka o kosteh.

Prispevek članka o kosteh je, da ti dve evidenci ohranja ločeni. Spojina lahko spremeni preživetje v poznem življenjskem obdobju pri enem spolu, ne da bi ohranila katero koli merjeno značilnost okostja. Podatki o preživetju zajemajo smrti zaradi vseh vzrokov; mikro-CT šteje opornike v vretencu. Nobeno pravilo ne določa, da mora poseg za podaljšanje življenja delovati prek kosti, in ta raziskava je neposreden dokaz, da je učinek metilenskega modrila v poznem življenjskem obdobju pri samicah potekal po neki drugi poti. Kdor ugotovitev o življenjski dobi navaja kot podporo metilenskemu modrilu pri osteoporozi, uporablja sredstva z napačnega računa. Splošno načelo ločevanja teh evidenc je predstavljeno v članku kako brati raziskave o metilenskem modrilu.

Zakaj posodica ni napovedala izida pri miši

Podatkom ustreza pet razlag, ki se med seboj ne izključujejo.

Prva je izpostavljenost. Celice v kulturi so bile neprekinjeno obdane z znanimi koncentracijami spojin. Miši so več mesecev jedle hrano z dodanima spojinama, raziskava pa ni merila niti njunih ravni v kostnem mozgu niti katerega koli označevalca oksidativnih poškodb v kosteh. Koncentracija, ki pri neposredni izpostavljenosti zavira osteoklaste, morda nikoli ne doseže predhodniških celic v kostnem mozgu v enaki višini. Članek je in vivo preizkusil en odmerek vsake spojine, zato odvisnost odziva od odmerka pri živali ostaja neznana.

Druga je kemija. Reaktivne kisikove zvrsti v celici ne tvorijo enega samega dobro premešanega rezervoarja. Delujejo v majhnih predelkih v kratkih časovnih intervalih, mitohondrijski, citosolni in membranski redoksni sistemi pa se vedejo delno neodvisno. Mitokinon je zasnovan tako, da se koncentrira v mitohondrijih, medtem ko lahko oksidativni signali, ki spodbujajo nastajanje osteoklastov, izvirajo od drugod. Zmanjšanje količine v enem predelku zato ne povzroči nujno istega učinka kot neprekinjena izpostavljenost celotne celice.

Tretja je povezanost procesov. V živi kosti sta resorpcija in tvorba povezani: osteoklasti in njihove sosednje celice oddajajo signale, ki na pravkar razgrajeno mesto privabijo celice, ki tvorijo kost. Zaviranje nastajanja osteoklastov ne pomeni enakega povečanja količine kostnine, saj lahko odstrani tudi signale, ki prikličejo graditelje. Posodica, v kateri so le predhodniške celice, te povratne zanke ne more pokazati. Okostje je ne more skriti.

Četrta je obremenitev. Osteociti zaznavajo mehansko deformacijo in določajo ravnovesje preoblikovanja celotne kosti. Ko se živali starajo in manj gibajo, mehanski signal slabi, izguba pa sledi ne glede na zmeren farmakološki vpliv na eno vrsto celic. Avtorji sami kot verjetnejši vzvod navajajo telesno vadbo in obremenitev, ki spodbuja izgradnjo kostnine. To je uglajen način povedati, da okostje bolj posluša fiziko kot redoksno kemijo.

Peta je čas začetka, vendar z zadržkom. V poskusu s C57BL/6J se je obravnava začela pri 18 mesecih, ko je že nastopila precejšnja izguba strukture. Nobeno antiresorptivno sredstvo ne more obnoviti trabekul, ki so bile preluknjane in odstranjene, brez ustrezne spodbude za tvorbo kostnine. Vendar čas začetka ne more pojasniti vsega, saj se je v programu Interventions Testing Program dajanje začelo v zgodnji odraslosti, pa še vedno ni ničesar spremenilo. Pozen začetek pojasni del enega poskusa. Drugega ne pojasni niti delno.

Kaj to pomeni za trditve o metilenskem modrilu pri osteoporozi

Za bralca, ki presoja metilensko modrilo za zdravje kosti ali staranje okostja, je praktični sklep kratek. Najboljši razpoložljivi dolgoročni dokazi pri miših ne kažejo koristi za okostje ob kroničnem dajanju metilenskega modrila ali mitokinona, kljub resničnemu učinku na osteoklaste v kulturi. Literatura o življenjski dobi metilenskemu modrilu pripisuje skromen učinek v poznem življenjskem obdobju le pri samicah, ta raziskava pa kaže, da ni potekal prek kosti. Nobena od obeh evidenc ne podpira uporabe pri ljudeh za osteoporozo, podatkov o človeških kosteh pa sploh ni. Vprašanja odmerjanja in varnosti izdelkov pri ljudeh sodijo v članek o varnosti in neželenih učinkih metilenskega modrila, ne v to raziskavo mišjega okostja.

Globlji nauk zadeva ravni dokazov. Celični rezultat je trditev o tem, kaj lahko spojina naredi eni vrsti celic pri nadzorovani izpostavljenosti. Rezultat na kosteh je trditev o tem, kaj večmesečna sistemska izpostavljenost naredi organu, ki povezuje dve vrsti celic pod mehanskim nadzorom. Prva raven je prostor, kjer se hipoteze rodijo. Druga je prostor, kjer je pri staranju okostja in teh dveh antioksidantih ta hipoteza ugasnila.