Metilensko modrilo pri poškodbah možganov: razumevanje predkliničnih dokazov

Udarec v glavo, zamašena arterija in počasi napredujoča nevrodegenerativna bolezen se lahko končajo z isto težavo: možgani nimajo več energije za svoje delo. Ta skupni končni izid pojasnjuje, zakaj se ista spojina vedno znova pojavlja v literaturi o vseh treh področjih. Toda skupni končni izid ne pomeni skupnega koncepta. Zdravljenje pred poškodbo, zdravljenje v prvi uri po njej in zdravljenje, katerega učinke merimo mesece pozneje, preverjajo različne zamisli, tudi če je v brizgi ista modra tekočina.

Ta članek obravnava del te literature, ki se nanaša na poškodbe. Pregleduje, kaj uporaba metilenskega modrila pri poškodbah možganov pomeni v poskusih na živalih, ločuje travmatske poškodbe od možganske kapi in kronične nevrodegeneracije ter pokaže, zakaj čas dajanja odmerka pojasnjuje večino razlik med študijami.

Tri vrste poškodb, en energetski izpad

Mehanizem, ki povezuje te modele, deluje v mitohondrijih. Običajno elektroni prehajajo po verigi prenosa elektronov, pri čemer nastaja ATP, zdrava veriga pa ohranja reaktivne kisikove zvrsti pod nadzorom. Po poškodbi deli verige začnejo odpovedovati, proizvodnja ATP upade, nastajanje prostih radikalov pa se poveča. Pregledni članek iz leta 2018 v reviji Molecular Neurobiology opisuje metilensko modrilo kot alternativni prenašalec elektronov: sprejema elektrone iz NADH in jih prenaša na citokrom c, kar poveča aktivnost kompleksa IV in obnovi sintezo ATP tudi takrat, ko je začetni del verige okvarjen.

Poročani podatki so konkretni. V celičnih preparatih in tkivnih rezinah se je aktivnost kompleksa IV povečala za 30 do 100 odstotkov, poraba kisika pa je sorazmerno narasla. To kaže, da so dodatni elektroni opravili koristno delo, namesto da bi uhajali v obliki radikalov. V modelu možganske kapi pri podganah je bila proizvodnja ATP v prizadetem predelu 24 ur po zdravljenju približno 30 odstotkov večja kot pri nezdravljenih živalih. Pregledni članek iz leta 2022 v reviji Biochemistry (Moscow) dodaja nadaljnje posledice: manj oksidativnega stresa, manj nevrovnetja, manj apoptoze ter učinke na monoaminooksidazo, sintazo dušikovega oksida, mitohondrijsko biogenezo, avtofagijo in agregacijo napačno zvitih beljakovin.

Zamisel je torej preprosta. Poškodba ovira običajno pot elektronov, metilensko modrilo pa ponuja obvoz. Vse, kar sledi, je vprašanje vrste poškodbe, časa dajanja in načina merjenja.

Travmatska poškodba ni možganska kap

V modelu travmatske poškodbe možganov sila deluje naenkrat. Primarna škoda je mehanska: tkivo se raztrga, žile počijo in krvno-možganska pregrada se v nekaj minutah poruši. Metilensko modrilo bi lahko vplivalo na sekundarni val, ki sledi v naslednjih urah in dneh, ko mitohondriji v preživelem tkivu odpovedujejo, se vnetje širi in nastaja edem. Merjeni izidi v teh študijah odražajo to zaporedje: volumen lezije, vsebnost vode v možganih, preživetje nevronov blizu mesta udarca in poznejše vedenje, na primer motorično okrevanje ali učenje v labirintu.

V modelu možganske kapi ali globalne ishemije je potek škodljivega dogodka drugačen. Pretok krvi se ustavi, v nekaj minutah sledi energetski izpad, obnovitev pretoka pa prinese še reperfuzijsko poškodbo. Tu je dajanje usklajeno z žilnim dogodkom, pogosto v nekaj minutah po okluziji ali reperfuziji, merjeni izidi pa v obdobju od nekaj ur do dneva ali dveh količinsko opredelijo akutno usodo tkiva: velikost infarkta, pretok krvi in zgodnje funkcionalno okrevanje. Eden od pristopov v literaturi o možganski kapi je predhodno zdravljenje, pri katerem živali prejmejo odmerek pred zaporo žile. S tem preverjajo preprečevanje na način, ki ga noben poskus s poškodbo glave ne more etično ponoviti pri ljudeh.

Rezultati pri možganski kapi so najmočnejši v literaturi o poškodbah in vključujejo tudi najjasnejši primer odsotnosti učinka. Pri podganah, ki so metilensko modrilo prejele ob reperfuziji po eni uri okluzije srednje možganske arterije, so bili infarkti na dan 2 za 30 odstotkov manjši, ohranil pa se je večji delež ogroženega jedra in penumbre (Shen, 2013). Študija s trajno okluzijo je ugotovila počasnejše napredovanje ogroženega tkiva v infarkt, vendar pri nobenem od dveh preizkušenih odmerkov ni bilo zmanjšanja končnega volumna infarkta po 24 urah (Rodriguez, 2014). Tretja študija okluzije je pri srednjem odmerku zmanjšala velikost infarkta približno za polovico ter neposredno dokumentirala ultrastrukturo mitohondrijev in mitofagijo v ishemičnih možganih. Ob tem je poročala o nepričakovani podrobnosti: izmerjena apoptoza se je povečala, medtem ko se je nekroza zmanjšala (Di, 2015). Pri globalni ishemiji pa je neprekinjena infuzija majhnega odmerka obnovila aktivnost citokrom c oksidaze, ravni ATP in potencial mitohondrijske membrane v ranljivem predelu CA1 hipokampusa, ohranila tamkajšnje nevrone in zaščitila prostorski spomin (Lu, 2016). Pri meritvah v predelu CA1 se velja ustaviti: gre za neposredne podatke o ATP in dihalni verigi iz poškodovanih možganov, o katerih literatura o travmatski poškodbi možganov (TBI) večinoma sklepa, namesto da bi jih merila.

Kronična nevrodegeneracija se razlikuje od obeh. V modelih Alzheimerjeve, Parkinsonove in Huntingtonove bolezni živali prejemajo odmerke več tednov ali mesecev, raziskovalci pa merijo agregacijo beljakovin, presnovo in prenos dopamina ali postopno upadanje kognitivnih sposobnosti. Ti izidi nimajo skoraj nič skupnega z lezijo, izmerjeno nekaj dni po udarcu. Bralci, ki rezultat iz ene skupine prenesejo v drugo, prenesejo ugotovitev čez mejo, ki je poskusi nikoli niso prestopili. Naš vodnik po literaturi o nevrodegeneraciji te dolgotrajne študije obravnava v njihovem lastnem okviru, primerjava z dokazi izključno o možganski kapi pa podrobno ločuje zasnove z zaporo žile od zasnov z udarcem.

Kaj so modeli TBI dejansko preverjali

Objavljena ni bila nobena raziskava metilenskega modrila pri travmatski poškodbi možganov pri ljudeh. Vsi podatki o TBI izvirajo iz poskusov na živalih, večinoma na podganah in miših, in so zbrani v majhnem naboru poskusov, ki jih je vredno navesti poimensko, saj se njihove podrobnosti razlikujejo na načine, ki jih povzetki zabrišejo.

V prvi študiji z nadzorovanim udarcem v možgansko skorjo so podgane eno uro po blagem udarcu intravensko prejele 1 mg/kg, nato pa po treh urah še 0.5 mg/kg (Watts, 2014). Volumen lezije, izmerjen z MRI, je bil pri zdravljenih živalih ves čas dvotedenskega spremljanja manjši. Število napačnih korakov pri preizkusu hoje se je pomembno zmanjšalo na dneve 1, 2 in 7, ne pa na dan 14. Pri mikroskopskem pregledu na dan 14 so v poškodovani skorji našteli 270 degenerirajočih nevronov na vidno polje v primerjavi s 368, nenormalno Nisslovo obarvanje pa pri 41 v primerjavi s 73. Z drugimi besedami: zgodnja zaščita, pri kateri je prednost v vedenjskih izidih do drugega tedna oslabela.

Zasnova z difuzno poškodbo je pri miših uporabila tekočinski udarec v sredinski črti in en sam intravenski odmerek 2 mg/kg v pol ure (Fenn, 2015). Zdravljene živali so imele manj izrazito izražanje vnetnih genov, manj vnetno aktiviranih mikroglijskih celic, manj opaznega edema in na dan 7 niso kazale depresiji podobnega vedenja. Enako pomembni so izidi brez učinka: sama poškodba je vsebnost vode v možganih povečala le zmerno, metilensko modrilo pa ni preprečilo izgube telesne mase ali motnje motorične koordinacije. Protivnetno delovanje ni isto kot popolna zaščita.

Dve študiji na miših sta uporabili isti režim, 1 mg/kg po eni uri, 0.5 mg/kg po šestih urah, nato pa dnevno dajanje tri dni, ter razširili razumevanje mehanizma. V modelu udarca v možgansko skorjo je zdravljenje zmanjšalo volumen lezije po 24 urah, po 72 urah in na dan 14, hkrati pa ohranilo nevrone in povečalo označevalce avtofagije (Zhao, 2016). V modelu tekočinskega udarca je zmanjšalo apoptozo nevronov, izboljšalo tesnost prepustne krvno-možganske pregrade in v dveh tednih izboljšalo nevrološke ocene (Shen, 2019). Vendar v študiji Zhao po 72 urah ni bilo razlike v vsebnosti vode v možganih, v študiji Shen pa na dneva 1 in 3 ni bilo razlike v uspešnosti na rotarodu. Izidi glede lezije in preživetja celic so se spremenili; otekanje in zgodnji motorični izidi tem spremembam niso vedno sledili.

Glede časa dajanja izstopa poskus z odloženim dajanjem (Watts, 2016). V istem modelu udarca so prvi odmerek odložili do 24 ur po poškodbi. Do dneva 2 je skupina z odloženim dajanjem pokazala zmanjšanje lezij, primerljivo z živalmi, zdravljenimi v prvih urah, zmanjšanje pa je vztrajalo tudi na dneva 7 in 14. Vedenjski signal je bil šibkejši: izboljšanje pri napačnih korakih v skupini z odloženim dajanjem je bilo statistično neznačilen trend. En laboratorij, en model, eno 24-urno časovno okno. To je pristen dokaz, da časovno okno sega dlje od prvih ur, obenem pa je to tudi celoten nabor dokazov za to trditev. Upoštevati je treba past v besedi »odloženo« drugje: ruska serija študij z naslovi o odloženi nevroprotekciji je odmerek dajala po 30 minutah, izraz »odloženo« pa je uporabljala za dolgotrajne izide, ne za pozen začetek.

Manjša študija žariščne poškodbe pri podganah dopolnjuje sliko časa dajanja z druge strani: tako dajanje neposredno pred poškodbo kot dajanje 30 minut po njej sta zmanjšala motnje delovanja okončin (Stelmashook, 2019). Predhodno zdravljenje v laboratoriju deluje prav zato, ker laboratorij določi čas poškodbe.

Pri tem je pomembna doslednost glede odmerkov. Pregledni članki opisujejo majhne odmerke kot spodbujevalne za mitohondrijsko dihanje, velike pa kot zaviralne, kar je isti dvofazni vzorec, ki ga opažamo v farmakologiji metilenskega modrila. Zato rezultatov ni mogoče razlagati kot »več modrila, boljše okrevanje«. Vsaka študija preverja eno točko na krivulji. Razlaga odnosa med odmerkom in odzivom sledi tej krivulji v različnih modelih, pregled varnosti in neželenih učinkov pa obravnava, kaj namesto tega povzročajo večji odmerki.

Če preglednico beremo po vrsticah: ista spojina, tri različne časovne lestvice. Preprečevanje sodi v srednjo vrstico, takojšnje zdravljenje v prvi dve, poznejši izidi pa v prvo in tretjo.

Preprečevanje, takojšnje zdravljenje, poznejši izidi

Trditev o preprečevanju je najlažje napačno razumeti. V modelih ishemije se živali, ki prejmejo odmerek pred okluzijo žile, odrežejo bolje. Ta rezultat se včasih navaja, kot da metilensko modrilo ščiti katerekoli možgane pred katerimkoli prihodnjim škodljivim dogodkom. Ne kaže ničesar takega. Kaže, da mitohondriji, pripravljeni z alternativno potjo elektronov, bolje prenesejo vnaprej načrtovano izgubo pretoka krvi. Nihče ne načrtuje poškodbe glave.

Dokazi o TBI so osredotočeni na takojšnje zdravljenje. Dajanje v urah po udarcu cilja na kaskado sekundarne poškodbe, ko ta še poteka: energetski izpad, oksidativni stres, vnetje in otekanje. Izboljšani izidi glede lezij in edema so resnični učinki zdravljenja, vendar gre za zdravljenje procesa, ne za obnovitev raztrganega tkiva.

Poznejši izidi so tretji koncept. Vedenje, merjeno več tednov po poškodbi, ali ravnanje z beljakovinami, merjeno več mesecev po začetku degenerativnega modela, odgovarja na vprašanje, ali je zgodnja zaščita vztrajala oziroma ali so počasni procesi spremenili potek. Manjša lezija po 24 urah, statistično neznačilen vedenjski trend po odmerku, odloženem za 24 ur, in izboljšanje pri nalogi v labirintu po več mesecih kroničnega dajanja so tri različne trditve s tremi različnimi dokaznimi zahtevami. Trenutno le prva svojo zahtevo izpolnjuje več kot enkrat.

Česa ti dokazi ne morejo pokazati

Vsak zgoraj navedeni rezultat ima isto omejitev. Mitohondriji glodavcev se na metilensko modrilo odzivajo na načine, ki bi lahko veljali tudi za človeške mitohondrije, vendar podgana, ki prejme intravenski odmerek nekaj minut po natančno odmerjenem udarcu, ni človek, ki pride na urgenco več ur po padcu. Anestezija, nadzorovana resnost poškodbe, mlade zdrave živali in kratko spremljanje omejujejo prenosljivost ugotovitev. Študija metilenskega modrila pri poškodbah zaradi eksplozij sploh ne obstaja, zato je prav vrsta poškodbe, ki je najpomembnejša za bralce iz vojaškega okolja, tista z najmanj dokazi.

Prav tako tu ni podlage za prenos odmerkov. Literatura o živalih uporablja intravensko in intraperitonealno dajanje v odmerkih, izbranih zaradi nadzora poskusa, ne peroralnih kapljic, ki se prodajajo v maloprodaji. Nobena od teh študij ne določa režima za ljudi in nobena ne preverja metilenskega modrila ob standardni oskrbi poškodb glave.

Pošten povzetek se zato prilega enemu odstavku. Pri glodavcih metilensko modrilo, dano približno v času travmatske ali ishemične poškodbe možganov, ohranja proizvodnjo energije v mitohondrijih, temu ohranjanju pa sledijo manjše lezije in boljše ocene okrevanja. V eni študiji udarca se je del učinka na lezijo ohranil tudi, ko so prvi odmerek odložili za 24 ur. Ali se karkoli od tega dogaja v poškodovanih človeških možganih, ni preverjeno, literatura o TBI in možganski kapi pa preizkuša različne čase dajanja glede na različne izide. Kdor na podlagi teh dokazov prodaja gotovost, dodaja sestavino, ki je poskusi nikoli niso vsebovali.