Ali lahko metilensko modrilo obide mitohondrijski kompleks III? Zakaj se študije ne strinjajo

Dva laboratorija sta preučevala, ali lahko metilensko modrilo obide blokirani mitohondrijski kompleks III. Eden je odgovoril ne. Drugi je odgovoril da. Oba sta imela podatke.

Prva študija na mitohondrijih mišjih možganov je ugotovila, da barvilo tega ne zmore. Druga, na možganskih mitohondrijih treh vrst glodavcev, je ugotovila, da to delno zmore. Tretja študija na mišjih jetrih se pogosto navaja v istem kontekstu, vendar je preizkušala nekaj drugega. Če jo obravnavamo v ustreznem okviru, se razjasni polovica zmede.

Ni univerzalnega mehanizma, ki bi ga lahko razglasili. Obstajajo trije poskusi z različnimi zaviralci, odmerki in merjenimi kazalniki. Najprej preberite pogoje. Sklepi sledijo iz njih.

Kaj tukaj pomeni obvod

Elektroni vstopajo v verigo skozi kompleks I (iz NADH) ali kompleks II (iz sukcinata), prehajajo skozi kompleks III do citokroma c, nato pa skozi kompleks IV do kisika. Gradient, ki pri tem nastane, celica izkorišča za tvorbo ATP.

Trditev o obvodu pomeni, da metilensko modrilo sprejme elektrone pred mestom blokade in jih odda za njim. Oksidirano barvilo sprejme elektrone iz NADH ali zgodnjih komponent verige in se pretvori v levkometilensko modrilo, reducirana oblika pa jih preda citokromu c ali nazaj v verigo. Če predaja poteka za mestom blokade, se dihanje in membranski potencial delno obnovita. Če poteka na mestu blokade ali pred njim, se ne obnovi nič.

Velik del tega spora je odvisen od ene podrobnosti kompleksa III. Kompleks izvaja cikel Q z dvema vezavnima mestoma za inhibitorje. Antimicin se veže na mesto Qi. Miksotiazol se veže na mesto Qo. Študija, ki uporablja samo enega od njiju, je preizkusila le polovico kompleksa.

Prva študija: brez obvoda v mitohondrijih mišjih možganov

Gureev in sodelavci so uporabili mitohondrije možganske skorje miši C57BL/6, izolirane z digitoninom, in jih analizirali pri 0.1 mg beljakovin na ml. Substrati so zajemali tri režime: piruvat in malat, vsak pri 5 mM, sukcinat pri 10 mM z glutamatom pri 2 mM ter L-prolin pri 10 mM. Zaviralca sta bila rotenon pri 1 mikromolarni koncentraciji (kompleks I) in antimicin pri 1 mikrogramu na ml (kompleks III). Odmerki barvila so bili 0.5, 1 in 2 mikromolarni, pri čemer je bila glavna koncentracija 1 mikromolarna. Metode in merilne krivulje so predstavljene v prispevku v reviji FEBS Letters.

Obvod kompleksa I je deloval. Rotenon je dihanje, spodbujeno z ADP, zmanjšal s približno 121 na približno 2 nmol na minuto na mg, barvilo pri 1 mikromolarni koncentraciji pa ga je obnovilo na približno 21. Membranski potencial se je obnovil ob piruvatu z malatom in ob L-prolinu.

Obvod kompleksa III ni deloval. Antimicin je dihanje zmanjšal na približno 16, barvilo pa ga je zvišalo le na približno 20. Membranski potencial se ni obnovil ob nobenem substratu, niti pri odmerkih barvila do 5 mikromolarne koncentracije. Podatki o peroksidu so kazali v isto smer: samo barvilo je sproščanje peroksida zvišalo z osnovne ravni okoli 76 pmol na minuto na mg na približno 1170, 1460 in 1945 pri treh odmerkih, antimicin pa je ta signal, ki ga je povzročilo barvilo, zmanjšal za približno 25, 88 oziroma 96 odstotkov. Če bi reducirano barvilo reagiralo neposredno s kisikom, blokada kompleksa III ne bi smela zavreti signala. Avtorji so sklepali, da se reducirano barvilo oksidira na mestu Qo kompleksa III, pred mestom blokade z antimicinom. Kratka zanka, opisana z besedami: donorji predajo elektrone barvilu, barvilo mestu Qo, nato sledi običajna pot. Rotenon je obiden. Antimicin ni.

Druga študija: delni obvod pri treh vrstah, na obeh mestih vezave inhibitorjev

Svab in sodelavci so razširili zasnovo. Možganske mitohondrije miši, podgan in morskih prašičkov so izolirali s Percollom in analizirali pri enakih 0.1 mg na ml, ob piruvatu z malatom ali glutamatu z malatom, vsakem pri 5 mM. Uporabili so dva zaviralca kompleksa III: antimicin A pri 0.3 mikromolarni koncentraciji in miksotiazol pri 1 mikromolarni koncentraciji. Barvilo je bilo pri večini meritev v 2 mikromolarni koncentraciji, pri poskusih s citokromom c pa v 0.5 mikromolarni koncentraciji. Vse tri vrste z usklajenimi protokoli so predstavljene v članku z odprtim dostopom.

Obe blokadi sta bili delno obideni pri vseh treh vrstah. V mišjih mitohondrijih je antimicin zavrl dihanje, barvilo pa ga je zvišalo za približno 60 odstotkov, s približno 37 na 59 nmol na minuto na mg. Miksotiazol ga je zavrl za 88 odstotkov, na približno 4.5, barvilo pa ga je zvišalo petkratno, na približno 23. Membranski potencial se je ob obeh inhibitorjih delno repolariziral, kar so merili z dvema barviloma (safraninom O in ratiometričnim TMRM), da bi izključili optične artefakte.

Ta članek je tudi neposredno preizkusil predajo elektronov, česar prva študija ni naredila. Eksogeni acetilirani citokrom c pri 25 mikromolarni koncentraciji se ob energiziranih mitohondrijih ni reduciral niti z inhibitorji niti brez njih, dodatek barvila pa je sprožil redukcijo v obeh primerih. V pufru brez celic je NADH skupaj z barvilom reduciral citokrom c s hitrostjo, sorazmerno z NADH. Daljši preskok, opisan z besedami: redukcijski ekvivalenti preidejo na barvilo, barvilo jih preda neposredno citokromu c, kompleks IV pa kisiku. Ta pot povsem preskoči kompleks III, zato je mogoče obiti oba zaviralca.

To razlago podpirata še dva merjena kazalnika. Fluorescenca NAD(P)H je ob dodatku barvila mitohondrijem, obdelanim z miksotiazolom, upadla, kar pomeni, da so redukcijski ekvivalenti odtekali po novi poti. Absorbanca barvila pri 660 nm je spremljala vsak zaporedni dodatek, supernatanti po centrifugiranju pa so pokazali, da se je oksidirano barvilo v energiziranih mitohondrijih nakopičilo v več kot stokratni koncentraciji, nato pa jih zapustilo, ko se je potencial porušil. Ujema se tudi protonska bilanca: preskok korakov črpanja pomeni približno 2 protona na par elektronov namesto 10, zato je hitrejša poraba kisika ob zgolj delni repolarizaciji pričakovana slika dejanskega obvoda, ne dokaz proti njemu.

Isti pripravek je pokazal odzive, ki hitro zavedejo pri površnem branju. Ob inhibitorju in barvilu je ADP dihanje znižal, namesto da bi ga zvišal, blokada transporta pa ga je spodbudila, namesto da bi ga upočasnila, medtem ko se je membranski potencial še vedno spreminjal v običajnih smereh. Sama poraba kisika je v tem sistemu zavajajoča.

Tretja študija: študija jeter, ki je preizkušala kompleksa I in II, ne III

Lee in Boelsterli sta uporabila mitohondrije mišjih jeter in gojene hepatocite, poškodovane z efavirenzem (kompleks I, IC50 okoli 30 mikromolarne koncentracije) in hidrazinom, presnovkom izoniazida (kompleks II, IC50 okoli 30 mikromolarne koncentracije). Barvilo pri približno 30 mikromolarni koncentraciji je obnovilo oksidacijo NADH, membranski potencial in ATP, hkrati pa zmanjšalo oksidante in nekrotično celično smrt. Članek v reviji Redox Biology to modelira kot prenos elektronov z barvilom mimo poškodovanih kompleksov I in II.

Ta rezultat je potrjen kontekst za del verige pred kompleksom III in o kompleksu III ne pove ničesar, saj ta v poskusu ni bil blokiran. Ne more potrditi ali ovreči nobene od študij možganov.

Matrika pogojev

Štirje razlogi, zakaj sta lahko obe študiji kompleksa III pravilni za svoje pogoje

1. Zaviralec ni pomenil enakega posega. Sam antimicin pri 1 mikrogramu na ml v primerjavi z antimicinom pri 0.3 mikromolarni koncentraciji in ločenim zaviralcem mesta Qo. Pot, po kateri barvilo dovaja elektrone na mesto Qo, odpove natanko tam, kjer neposredna pot do citokroma c uspe. Eno mesto ne more predstavljati obeh.

2. Odmerek barvila in časovni potek sta se razlikovala. Glavni koncentraciji sta bili 1 in 2 mikromolarni pri snovi, ki kroži med redoks stanji in katere privzem ter neposredna redukcija citokroma c sta odvisna od koncentracije in časa. Majhne razlike v odmerku in različen čas merjenja lahko razkrijejo različne odseke istega omrežja.

3. Pripravki so se razlikovali. Izolacija z digitoninom in izolacija z gradientom Percoll izbereta prekrivajoče se, vendar ne enake populacije mitohondrijev. Koncentracija beljakovin je bila enaka, 0.1 mg na ml, zato ta spremenljivka odpade, podpopulacija in celovitost pa ne. Tudi vrsta je bila izključena kot razlog za razliko: druga skupina je svoj fenotip ponovila tudi pri miših.

4. Substratni pogoji določajo, kaj barvilo zmore. Trije substratni režimi v primerjavi s pari, povezanimi z NADH. Razpoložljivost NADH in membranski potencial skupaj določata, kako hitro se barvilo reducira in kam se porazdeli; pot, ki potrebuje reducirano barvilo ob oksidiranem citokromu c, pa je odvisna od te izbire.

Kako brati naslednjo trditev o obvodu

Vprašajte, kateri kompleks je bil blokiran, s katerim inhibitorjem, na katerem mestu in pri katerem odmerku. Vprašajte po koncentraciji barvila in času merjenja. Vprašajte po tkivu, vrsti, izolaciji, koncentraciji beljakovin in substratu. In vprašajte, ali se potencial, dihanje, redoks stanje in neposredni preizkus predaje elektronov ujemajo, saj je sama poraba kisika tukaj več kot enkrat vodila do napačne razlage.

Ozek povzetek ostaja veljaven. Glede obvoda kompleksa I z barvilom obstaja soglasje. Pri kompleksu III mišji mitohondriji z antimicinom pri 1 mikrogramu na ml in barvilom pri 1 mikromolarni koncentraciji ne kažejo funkcionalnega obvoda, medtem ko tri vrste z antimicinom pri 0.3 mikromolarni koncentraciji ali miksotiazolom pri 1 mikromolarni koncentraciji in barvilom pri 2 mikromolarni koncentraciji kažejo delni obvod z neposrednim prenosom z barvila na citokrom c. Ti trditvi lahko veljata hkrati. Vse širše trditve so ekstrapolacija.

Sorodno branje umešča sporno trditev v okvir nesporne kemije: kako metilensko modrilo prenaša elektrone za zaporedno predajo, poskusi obvoda kompleksa I za potrjeni primer v predhodnem delu verige, meritve membranskega potenciala in njihovi artefakti za pojasnilo, zakaj sta bili potrebni dve barvili, ter laboratorijsko ravnanje s snovmi, ki krožijo med redoks stanji, za pasti pri odmerjanju in časovnem poteku.