Metilensko modrilo in feroptoza: železo, lipidna peroksidacija in celična smrt

Feroptoza je celična smrt zaradi poškodb membrane. Večkrat nenasičene maščobe v membranah oksidirajo v verižni reakciji, membrana odpove in celica odmre. Za te kemijske reakcije je potrebno železo. Ta stavek povzema celoten koncept, vse v tem članku pa preverja enega od njegovih delov.

Vprašanje tukaj je ožje: kako metilensko modrilo vpliva na to verigo v poskusih na celicah in kaj ta rezultat dejansko pokaže. Kratek odgovor je, da je v dveh laboratorijskih študijah metilensko modrilo v nanomolarnih koncentracijah zmanjšalo mitohondrijsko lipidno peroksidacijo in ohranilo celice pri življenju po izpostavitvi sprožilcem, ki sicer povzročijo feroptozo. Daljši odgovor je pomembnejši, ker je bil vsak člen verige preverjen z drugačnim posegom, vsak poseg pa ima svoje omejitve.

Feroptoza v enem odstavku

Membranski fosfolipid z repom iz večkrat nenasičene maščobne kisline ima šibko točko: vodikove atome, ki jih je lahko odvzeti. Ko radikal odvzame enega od njih, se na lipid veže kisik, nastane lipidni peroksilni radikal, ta pa odvzame vodik naslednjemu lipidu. Reakcija se širi vzdolž membrane, dokler je nekaj ne ustavi.

Glavni zaviralni mehanizem je encim GPX4, ki z glutationom reducira lipidne perokside v neškodljive lipidne alkohole. Laboratorijski sprožilci to obrambo napadejo na določenih mestih. Erastin blokira vnos cistina prek sistema xc-minus, zaradi česar celici zmanjka cisteina za sintezo glutationa. Butionin sulfoksimin neposredno blokira sintezo glutationa. RSL3 zavira sam GPX4. Pri vseh treh peroksidi ostanejo neodstranjeni, vendar vsak deluje na drugem koraku, zato rezultata z enim sprožilcem ni mogoče samodejno posplošiti na druge.

Feroptoza se od apoptoze razlikuje po svojih opredeljujočih značilnostih. Ni kaspazne kaskade in ni apoptotičnih telesc. Kelatorji železa, kot je deferoksamin, in snovi, ki lovijo radikale, kot je ferrostatin-1, jo zavirajo. To je praktični preizkus, s katerim raziskovalci smrt opredelijo kot feroptotično in ne zgolj nekrotično. Širši pregled poti uravnavane celične smrti postavi to razliko v kontekst, ravnanje celic z labilnim železom pa pojasni, zakaj je kelacija tako odločilen kontrolni poseg.

Kje sodelujejo mitohondriji in zakaj je bilo to sporno

Zgodnje raziskave so poročale, da feroptoza poteka tudi v celicah brez mitohondrijske DNA, kar je nakazovalo, da mitohondriji niso nujni. Poznejše raziskave so pokazale, da lahko odstranitev mitohondrijev ali blokada dihanja zavre feroptozo zaradi pomanjkanja cisteina, ne pa tudi zaradi neposrednega zaviranja GPX4. Oba rezultata sta lahko pravilna, če je prispevek mitohondrijev odvisen od sprožilca, vrste celic in mesta, kjer poteka odločilna peroksidacija.

Študija, na kateri temelji ta članek, je spor obravnavala s sondo, specifično za celični razdelek. MitoCLox je različica kazalnika lipidne peroksidacije, usmerjena v mitohondrije: ob stiku z lipidnimi peroksilnimi radikali znotraj mitohondrijev spremeni fluorescenco. V fibroblastih, izpostavljenih erastinu, se je oksidacija mitohondrijske sonde pojavila še v živih celicah pred njihovo smrtjo, med celicami v populaciji pa se je razlikovala. Ta časovni potek je pomemben. Peroksidacija, ki se pojavi pred smrtjo, je možen vzrok. Peroksidacija, izmerjena le v mrtvih celicah, je ostanek. Spremljevalni vodnik o testih lipidne peroksidacije in tem, kaj pokaže posamezna sonda pojasnjuje, zakaj mesto sonde določa pomen signala.

Enak vzorec se je pojavil v drugem modelu. Fibroblasti bolnika z Leberjevo dedno optično nevropatijo, ki imajo mutacijo kompleksa I in višji osnovni oksidativni stres, so ob izčrpanju glutationa odmrli s feroptozo, kontrolni fibroblasti pa so bili odporni. Oksidacija mitohondrijske sonde se je tudi tokrat pojavila najprej. Podrobnosti so v študiji mitohondrijske lipidne peroksidacije pri feroptozi v fibroblastih.

Kaj je metilensko modrilo spremenilo v teh poskusih

Metilensko modrilo je redoks prenašalec. Njegova oksidirana oblika sprejema elektrone iz reakcij, povezanih z NADH, v kompleksu I, njegova reducirana oblika pa jih oddaja citokromu c, ki jih dovaja kompleksu IV. Tako nastane delni obvod odseka verige, kjer elektroni običajno uhajajo na kisik in tvorijo superoksid. Bralci, ki želijo celovito sliko prenosa, naj začnejo pri razlagi, kako metilensko modrilo prenaša elektrone skozi mitohondrije.

V pljučnih fibroblastih, izpostavljenih erastinu, je metilensko modrilo pri 250-nanomolarni koncentraciji ohranilo viabilnost v testu preživetja celic, tako kot antioksidanta SkQ1 in MitoTEMPO, usmerjena v mitohondrije. Kontrolni poskusi določajo obseg trditve. Tudi ferrostatin-1, alfa-tokoferol in deferoksamin so zaščitili celice, kar potrjuje, da je bila smrt feroptotična. Analog SkQ1 brez antioksidativne skupine ni zaščitil celic, kar kaže na redoks kemijo in ne na nespecifično kopičenje. Zaščita je oslabela nad približno 200-nanomolarno koncentracijo SkQ1, kar je skladno z znanim prooksidativnim delovanjem kinonskih antioksidantov pri večji obremenitvi. Tudi metilensko modrilo ima tak dvojni učinek, odvisen od odmerka: v teh poskusnih posodah je pri nizkih nanomolarnih koncentracijah zaščitno, pri višjih koncentracijah ali močni osvetlitvi pa lahko z redoks cikli tvori vodikov peroksid. Tak kontekst odmerka je obravnavan v članku o reaktivnih kisikovih zvrsteh v mitohondrijih.

Poskusi z izoliranimi mitohondriji so nato ločili vire ROS. Ob prisotnosti dvovalentnega železa so substrati, ki dovajajo elektrone kompleksu I, skupaj z rotenonom spodbudili oksidacijo sonde. Rotenon blokira prenos za flavinskim mestom, zato prenašalci pred blokado ostanejo reducirani, elektroni pa uhajajo na kisik s flavina, obrnjenega proti matriksu. Substrati, ki dovajajo elektrone kompleksu III, skupaj z antimicinom A so povzročili obilno nastajanje vodikovega peroksida, vendar niso sprožili lipidne peroksidacije. Enak skupni signal ROS, druga lokacija, drugačen izid. Tako SkQ1 kot metilensko modrilo sta zavrla peroksidacijo, ki jo je sprožil kompleks I, ne da bi zavrla samo nastajanje vodikovega peroksida. To umešča njuno delovanje za nastanek ROS, na korak lipidne peroksidacije.

Veja z železovo preobremenitvijo in namig lipofuscina

Druga študija je vprašanje obravnavala z vidika železa. V kardiomiocitih H9c2, izpostavljenih submilimolarni koncentraciji amonijevega železovega(III) citrata, so nastali mitohondrijski ROS, nato mitohondrijska lipidna peroksidacija in feroptoza, čemur je v 24 urah sledilo kopičenje pigmenta, podobnega lipofuscinu. Lipofuscin je avtofluorescentni ostanek oksidiranih lipidov in beljakovin, ki vsebuje železo in se kopiči s starostjo. Njegov hiter pojav v tem poskusu povezuje akutno peroksidacijo, ki jo sproži železo, s klasičnim označevalcem staranja. Tako metilensko modrilo v nanomolarnih koncentracijah kot SkQ1 sta preprečila peroksidacijo, smrt in kopičenje pigmenta. Izolirani srčni mitohondriji so potrdili vzorec: rotenon skupaj z dvovalentnim železom je sprožil peroksidacijo in signal, podoben pigmentnemu, obe snovi pa sta to preprečili. Celotno zaporedje je opisano v študiji železove preobremenitve v kardiomiocitih H9c2. Pigmentni vidik te zgodbe sodi k temi lipofuscina in označevalcev celičnega staranja.

Česa testi preživetja celic ne pokažejo

Test viabilnosti, kot je CellTiterBlue, pokaže, koliko celic v poskusni posodi ostane presnovno aktivnih po izpostavitvi sprožilcu in potencialni zaščitni snovi. To je preizkus mehanizma v opredeljenem sistemu. Ni izid zdravljenja. V nobenem od teh poskusov niso bolniku dali odmerka, merili izida bolezni ali določili terapevtskega okna v telesu.

Štiri omejitve je treba izrecno navesti. Prvič, nabor vrst celic je ozek: transformirani pljučni fibroblasti, primarni kožni fibroblasti, vključno z eno linijo z mitohondrijsko boleznijo, in celična linija podganjih kardiomiocitov ter izolirani mitohondriji podganjega srca. Občutljivost se je med linijami razlikovala, linija LHON pa je bila namenoma izbrana kot izrazito ranljiva. Drugič, sprožilci so laboratorijske skrajnosti: popolna blokada transporta ali sinteze in železove obremenitve, ki jim nobeno tkivo ne bi bilo akutno izpostavljeno. Tretjič, koncentracije ni mogoče pretvoriti s preprostim množenjem. Nanomolarna koncentracija v gojišču ni odmerek za človeka. Med poskusno posodo in človekom so porazdelitev metilenskega modrila, njegova redukcija v brezbarvno obliko v krvi in tkivih, izpostavljenost svetlobi in membranski potencial. Četrtič, sonde poročajo o svojem celičnem razdelku. Oksidacija MitoCLox kaže, da so nastali mitohondrijski lipidni radikali; ne kaže pa, da je bilo pretrganje plazemske membrane, verjetno končni dogodek, preprečeno neposredno in ne s prekinitvijo predhodnih korakov.

Poštena trditev je torej naslednja: v teh modelih ROS, ki izvirajo iz kompleksa I, skupaj z železom sprožijo mitohondrijsko lipidno peroksidacijo, ki se pojavi pred feroptozo, metilensko modrilo pa pri nizkih koncentracijah prekine ta odsek. Vse, kar presega ta odsek, zahteva drugačne poskuse na živalih in nato na ljudeh.