Članek
Metilensko modrilo kot antioksidant in prooksidant: kaj spremeni izid?
Predpostavimo, da dva laboratorija preizkusita isto modro barvilo in poročata o nasprotnih rezultatih. V prvem izolirani možganski mitohondriji bolje dihajo in tvorijo več ATP. V drugem isti pripravek sprošča veliko več vodikovega peroksida. Obe poročili sta pravilni. Opisujeta isti cikel z dveh različnih strani, zmeda pa nastane, ko bralci eno stran razumejo kot celotno zgodbo.
Napaka je v vprašanju, katera oznaka ustreza molekuli. Metilensko modrilo je prenašalec elektronov, kot v širšem kontekstu prikazuje pregled njegovih tarč v celični biologiji. Oksidirano barvilo sprejme elektrone in postane brezbarvni leucoMB. LeucoMB te elektrone preda naprej in znova postane moder. Kaj opazimo, je odvisno od tega, kdo elektrone oddaja, kdo jih sprejema in ali lahko sistem odstrani vodikov peroksid, ki nastaja med tem procesom. Smiselno vprašanje zato nikoli ni, ali je barvilo antioksidant. Vprašati se je treba, kaj pogoji omogočajo temu prenašalcu.
Cikel, ki ustvarja obe plati
V temi je osnovni cikel kratek. NADH, NADPH ali prenašalci v dihalni verigi reducirajo barvilo. Reducirano barvilo ima nato več konkurenčnih poti. Elektrone lahko prenese na citokrom c in podpira tok mimo poškodovanega kompleksa, zato se pri blokadi kompleksa I ali III dihanje in membranski potencial delno obnovita. Lahko pa elektrone prenese neposredno na kisik, kar obnovi modro obliko in tvori vodikov peroksid. Ker se barvilo obnavlja, lahko že majhna količina ta cikel ponovi večkrat ter pri tem neprestano porablja redukcijske ekvivalente in tvori peroksid.
Dve dodatni poti povsem spremenita kemijsko dogajanje. Prosti baker ali železo ta difuzibilni peroksid prek reakcij Fentonovega tipa pretvorita v veliko bolj uničujoče lokalne oksidante. Rdeča svetloba odpre ločeno fotokemijsko pot, pri kateri vzbujeno barvilo prenese energijo na kisik in tvori singletni kisik, zvrst, podrobno obravnavano v razlagi fotokemije tipa I in tipa II. Redoks kroženje v temi, poškodbe, okrepljene s kovinami, in fotodinamične poškodbe so trije različni mehanizmi, ki imajo po naključju isto izhodiščno molekulo.
Matrika pogojev in izidov
Spodnjo tabelo je vredno shraniti. Vsaka vrstica prikazuje eno spremenljivko, smer njenega vpliva in poskus, ki to podpira. Pozitivno pomeni zaščitni učinek ali izboljšano izmerjeno vrednost. Neugodno pomeni več oksidantov, več izčrpavanja ali več poškodb.
| Pogoj | Smer izida | Kaj je pokazal poskus |
|---|---|---|
| Nizka koncentracija, 0.1 do 1 uM, izolirani mitohondriji | Pozitiven vpliv na bioenergetiko in več peroksida | 0.1 uM je izboljšalo porabo kisika v srčnih mitohondrijih zdravih in diabetičnih podgan; 100 nM do 1 uM je delno obnovilo ATP, membranski potencial in privzem kalcija v možganskih mitohondrijih z blokirano dihalno verigo, medtem ko se je sproščanje peroksida povečalo v vseh pogojih |
| Višja koncentracija, nad 5 uM, celice brez glukoze | Neugoden signal oksidantov | Endotelijske celice so ob odsotnosti glukoze pri koncentracijah nad 5 uM oksidirale splošno sondo za ROS in izgubljale reducirani glutation; dodatek glukoze je preprečil oboje |
| Substrati kompleksa I (glutamat in malat) | Več peroksida | Raziskave možganskih in srčnih mitohondrijev so pokazale povečano sproščanje peroksida s substrati, povezanimi z NADH |
| Sukcinat in rotenon, srčni mitohondriji, 0.1 uM | Manj peroksida v tem protokolu | Edini jasno antioksidativni rezultat merjenja peroksida v tem naboru; upoštevajte, da je protokol vključeval rotenon in drugo tkivo, zato sam substrat tega ne pojasni |
| Rdeča svetloba, 20 uM in 630 nm | Neugodne poškodbe DNA | Pri 20 uM v temi ni bilo pomembnih poškodb mitohondrijske DNA; ista koncentracija ob rdeči svetlobi je poškodovala vsak preizkušeni fragment |
| Zelo visoka koncentracija v temi, 100 uM | Neugodne selektivne poškodbe DNA | Selektivne poškodbe mitohondrijske DNA na zaporedjih, bogatih s purini, kar pomeni kakovosten preskok glede na signal peroksida pri nanomolarnih koncentracijah |
| Baker ali železo in NADH, DNA v brezceličnem sistemu | Neugodne oksidativne poškodbe | Baker je usmerjal poškodbe na mutacijsko vročo točko v zaporedju p53; železo EDTA je povzročilo razširjene poškodbe; katalaza in kelatorji kovin so blokirali pripadajoče poti; količina oksidiranega gvanina se je povečala |
| Prisotna glukoza, nepoškodovane celice | Zaščitno blaženje kljub hitrejšemu kroženju | Glukoza je povečala redukcijo barvila, vendar zmanjšala neto stres, kar je skladno z oskrbo z NADPH prek pentozofosfatne poti za obnavljanje antioksidantov |
| Celice z zalogo askorbata | Mešano: askorbat se porablja, signal sonde pa se blaži | Barvilo je postopoma oksidiralo znotrajcelični askorbat tudi ob prisotni glukozi, hkrati pa delno zaviralo oksidacijo sonde; ceno je plačala obrambna zaloga |
| Živali, izpostavljene rotenonu, barvilo dano pred njim | Pozitiven izid v tkivu | Predhodno dajanje barvila je zmanjšalo poškodbe mitohondrijske DNA, ki jih je rotenon povzročil v srednjih možganih miši, čeprav je povečalo peroksid v izoliranih mitohondrijih |
Bistven je vzorec, ki se pokaže med vrsticami. Tvorba peroksida in biološka zaščita sta ločeni osi. Obravnava ima lahko hkrati neugoden rezultat na prvi in pozitiven rezultat na drugi.
Zakaj isti odmerek daje različne odgovore
Koncentracija določa zmogljivost prenosa, ne pa končnega izida. Sproščanje peroksida iz možganskih mitohondrijev se je v raziskavi nepoškodovanih možganskih mitohondrijev zaznavno povečalo od 50 nM naprej, medtem ko je bila za očitne poškodbe mitohondrijske DNA v temi potrebna koncentracija 100 uM. To je približno dvatisočkratna razlika med prvim signalom in genotoksičnostjo, vendar ni varnostna meja. Končne točke, razdelki in časi izpostavljenosti se razlikujejo, zato številke označujejo različne pojave, ne pa točk na eni krivulji. Razprava o odnosu med odmerkom in odzivom takšno razliko med šibkim signalom in izrazitimi poškodbami umešča v širši kontekst hormeze.
Substrat določa, kje elektroni vstopajo. Goriva, povezana z NADH, barvilu zagotavljajo obilico redukcijskih ekvivalentov tako za koristni obvod kot za potratno reakcijo s kisikom. Pogosto navajani povzetek, da sukcinat barvilo naredi antioksidativno, glutamat pa prooksidativno, podatke razlaga preveč široko. Pogoj za merjenje peroksida s sukcinatom v srčni raziskavi je namreč vseboval tudi rotenon ter uporabil drugo tkivo in odmerek kot raziskava možganskih mitohondrijev, ki je ugotovila povečan peroksid pri vsakem substratu in stanju dihanja.
Svetloba spremeni mehanizem, ne le obsega učinka. Najjasnejša primerjava v tem naboru je med 20 uM v temi, kjer na fragmentih mitohondrijske DNA ni bilo zaznavnega učinka, in 20 uM ob rdeči svetlobi, kjer so bili poškodovani vsi fragmenti. Kdor primerja osvetljen poskus s poskusom v temi, primerja fotokemijo z redoks kroženjem.
Kovine pretvorijo oksidant. Brez kovin cikel barvila v temi tvori peroksid, difuzibilno molekulo, ki jo celice uporabljajo tudi kot signal. Ob dostopnem bakru ali železu barvilo, reducirano z NADH, omogoča redukcijo kovine, reducirana kovina pa ob DNA aktivira peroksid v zvrsti hidroksilnega tipa ali bakrove peroksidne zvrsti. Tako so raziskave v brezceličnih sistemih z NADH in kovinskimi ioni iz istega izhodiščnega barvila povzročile tako selektivne poškodbe na mutacijskih vročih točkah kot razširjene poškodbe DNA. Ali je ta pot pomembna, določa uravnavanje kovin v posameznem razdelku, ne zgolj barvilo.
Razpoložljivost goriva določa, ali celica zmore plačati ceno. V endotelijskih celicah, izpostavljenih 2 do 20 uM barvila, je odstranitev glukoze razkrila oksidativno breme, oskrba z glukozo pa ga je odpravila, čeprav je glukoza hkrati pospešila redukcijo barvila. Hitrejše kroženje ob oskrbljenih obrambnih sistemih je ugodnejše od počasnejšega kroženja ob izčrpanih obrambnih sistemih. Vsako trditev o oksidantih, ki ne navaja stanja glukoze ali NADPH, obravnavajte kot nepopolno.
Tkivo določa razpoložljivo opremo. Endotelijske celice obnavljajo NADPH prek presnove glukoze in imajo citosolne zaloge antioksidantov. Izolirani mitohondriji nimajo nič od tega. Prečiščena DNA nima niti popravljalnih mehanizmov. Rezultat v enem pripravku pove malo o drugih, zato bo moral načrtovani članek o tkivno specifičnih odzivih te sisteme obravnavati ločeno.
Neposredno merjenje ni isto kot poznejši obrambni odziv
Številna besedila združujejo dve ravni, ki ju poskusi ločujejo. Ena raven sprašuje, koliko oksidanta se je pojavilo. Druga sprašuje, kako se je celica odzvala.
Testi za peroksid tipa Amplex so najbližje prvi ravni, pa tudi ti poročajo o neto toku, torej o tvorbi, zmanjšani za razgradnjo in iznos. Raziskava možganskih mitohondrijev je ugotovila spremembe na obeh straneh: nastajalo je več peroksida, odstranjevanje dodanega bolusa peroksida pa je bilo počasnejše. Dlje v zaporedju so oksidacija glutationa, poraba askorbata, oksidirani gvanin in poškodbe DNA, ki blokirajo polimerazo. Vsak korak med oksidant in izmerjeno vrednost doda biološke procese.
Antioksidativni encimi, katerih izražanje spodbuja Nrf2, in mitohondrijska biogeneza sodijo na drugo raven. To so prilagoditveni programi, ki jih lahko sproži blag pulz peroksida. Avtorji raziskave zaščite možganskih mitohondrijev predlagajo prav tak sprožilni učinek blagega stresa, ob tem pa opozarjajo, da vzročna veriga prek Nrf2 temelji na predhodnih raziskavah, ne na njihovem lastnem celovitem dokazu. Zaščita, ki se po več urah pojavi prek novih beljakovin, ne pomeni, da je bilo začetno kemijsko dogajanje antioksidativno. Pomeni, da je majhen prooksidativni dogodek omogočil močnejšo obrambo. Usmeritve za presojo takšnih trditev, vključno z omejitvami testov in razlikami med pripravki, obravnava vodnik za branje raziskav o metilenskem modrilu.
Zakaj se rezultati testov ne ujemajo
Splošna sonda, kot je dihidrofluorescein, poroča o širši oksidaciji sonde, ne o koncentraciji peroksida. Odvisna je od kemijskih procesov s peroksidazo in hemom ter lahko spregleda porast peroksida, ki ga kalibriran test Amplex zazna. Raziskava možganskih mitohondrijev je pokazala izrazito višji peroksid brez ustreznega signala superoksida, kar opozarja pred navajanjem kakršne koli trditve o antioksidativnosti na podlagi ene same barvilne sonde. Optično prekrivanje je upravičeno vprašanje za kontrolni preizkus, saj barvilo absorbira vidno svetlobo blizu običajnih vzbujevalnih in emisijskih pasov. Vendar je skrbno izvedena raziskava uporabila kalibracijo z znanimi koncentracijami peroksida, zmanjšala izpostavljenost vzbujevalni svetlobi z le majhno spremembo signala in z ločeno elektrodo potrdila počasnejše odstranjevanje peroksida. Interferenco je treba preveriti s kontrolnim preizkusom, ni pa samodejen razlog za zavrnitev rezultata.
Rezultat glede kalcija ponazarja enako potrebo po natančnosti. Akutna izpostavitev barvilu v srčni raziskavi ni spremenila skupne obremenitve s kalcijem pred prehodom prepustnosti, vendar je izboljšala hitrost privzema kalcija v možganskih mitohondrijih z blokirano dihalno verigo v raziskavi srčnih mitohondrijev, osredotočeni na diabetes. Različne končne točke, različni sistemi, nobenega protislovja.
Kontrolni seznam, preden zaupate presoji
Vsako presojo o antioksidativnem ali prooksidativnem delovanju obravnavajte kot poročilo o sistemu in si zastavite pet vprašanj. Pri kateri koncentraciji in v katerem razdelku? S katerim donorjem elektronov in katerim konkurenčnim akceptorjem? Ob svetlobi ali v temi ter pri kateri valovni dolžini in dozi? Katere kovine so na voljo ter kakšna je oskrba z gorivom in zalogami antioksidantov? In s katerim testom: takim, ki meri tok oksidantov, poškodbe ali prilagoditveni odziv? Spremenite kateri koli odgovor in ista molekula se lahko v matriki premakne od zaščitnega do škodljivega delovanja brez kakršnega koli paradoksa.