Alternative metilenskemu modrilu za mikroskopijo

Pri preprostem bakterijskem razmazu lahko kristalno vijolično nadomesti metilensko modrilo, kadar je cilj opazovati obliko celic. Pri živih celicah je lahko boljša alternativa fazni kontrast brez kakršnega koli barvila. Izbira je odvisna od opažanja, ki ga morate opraviti.

Predstavljajte si, da dve osebi preučujeta isto bakterijsko kulturo. Ena želi razlikovati paličaste celice od okroglih. Druga želi ugotoviti, ali je določena obdelava bakterije uničila. Barvilo, ki prvi osebi omogoči jasno sliko, drugi morda ne bo dalo uporabnega odgovora.

Pred izbiro nadomestka dokončajte ta stavek: »Opazovati moram ___ v ___, celice pa morajo / jim ni treba ostati žive.« Ta stavek opredeli nalogo, ki jo mora opraviti barvilo.

Začnite z vzorcem in vprašanjem

Najprej določite, ali morajo celice ostati žive, nato pa opredelite lastnost, ki jo morate opazovati:

Celice morajo ostati žive: za gibanje ali obliko razmislite o neobarvanem faznem kontrastu ali DIC; za jedrno DNA razmislite o Hoechst 33342 s fluorescenco; za celovitost membrane izberite validiran test, kot je SYTO 9 s propidijevim jodidom.
Celice lahko prenehajo biti žive: za morfologijo bakterij razmislite o preprostem barvanju s kristalno vijoličnim ali negativnem barvanju z nigrozinom; za Gramovo reakcijo uporabite celotno metodo barvanja po Gramu; za jedrno DNA v fiksiranih celicah razmislite o fluorescenci DAPI. S to tabelo primerjajte omejitve posamezne možnosti. Gre za izbiro metod, ne za navodila za zamenjavo stekleničk z reagenti v obstoječem protokolu.

Kaj morate opazovati	Vzorec in oprema	Možna alternativa	Glavna omejitev
Oblika in razporeditev bakterij	Pripravljen bakterijski razmaz; svetlo polje	Preprosto barvanje s kristalno vijoličnim	Prikaže morfologijo; ne določa Gramove reakcije ali viabilnosti.
Obrisi celic na temnem ozadju	Bakteriološki pripravek; svetlo polje	Negativno barvanje z nigrozinom	Pomembna sta priprava in formulacija; neobarvana celica ni nujno živa.
Gramova reakcija	Pripravljen bakterijski razmaz; svetlo polje	Celotna metoda barvanja po Gramu	Zahteva celotno zaporedje reagentov in kontrol.
Gibanje ali spremembe v živih celicah	Združljiv mokri pripravek; fazni kontrast ali DIC	Brez barvila	Zahteva ustrezno optiko; kontrast ne identificira molekule.
Jedrna DNA	Fiksirane celice; fluorescenca	DAPI	Zahteva združljive filtre za vzbujanje in emisijo.
Jedrna DNA v živih celicah	Žive celice; fluorescenca	Hoechst 33342	Vstop v celico ne dokazuje, da so pogoji slikanja neškodljivi.
Celovitost bakterijske membrane	Nefiksirane bakterije; fluorescenca	SYTO 9 s propidijevim jodidom	Barvanje membrane je posredna mera viabilnosti.

Pri preprostem razmazu metodo nadomestite previdno

Kristalno vijolično je praktičen kandidat, kadar je naloga enobarvni prikaz morfologije bakterij. FDA-jev Bacteriological Analytical Manual navaja dve formulaciji kristalno vijoličnega, primerni za preprosto barvanje. Uporabite dokumentirano formulacijo in njen način priprave; samo ime barvila še ne določa delovnega reagenta.

Kristalno vijolično se uporablja tudi pri barvanju po Gramu, vendar zaradi tega preprosto barvanje s kristalno vijoličnim še ni barvanje po Gramu. V protokolu ASM za barvanje po Gramu je diferencialni rezultat odvisen od zaporednega delovanja kristalno vijoličnega, joda, razbarvanja in kontrastnega barvanja. Če te korake izpustite, se spremeni, kaj je mogoče iz slike ugotoviti. Za razlago te razlike glejte preprosto barvanje v primerjavi z barvanjem po Gramu.

Nigrozin omogoča drugačen način prikaza obrisov: potemni ozadje, bakterijske celice pa ostanejo razmeroma svetle. V Merckovih navodilih za nigrozin je pomembna podrobnost, ki jo splošen seznam nadomestkov lahko spregleda. Navedena delovna formulacija vsebuje formaldehid. Zato iz izraza »negativno barvanje« ne morete sklepati, da je metoda združljiva z živimi celicami, čeprav so same celice videti neobarvane. Preverite celotno formulacijo in pripravo vzorca.

Pri živih vzorcih razmislite o spremembi optike

Če želite opazovati premikanje ali delitev celic, lahko dodajanje drugega barvila oteži opazovanje. Kot Nikon pojasnjuje v svojem vodniku o kontrastu pri prozornih vzorcih, fazni kontrast in diferencialni interferenčni kontrast oziroma DIC omogočata vidnost vzorcev na podlagi razlik v njihovih optičnih lastnostih. Omogočata prikaz živih, neobarvanih celic, če ima mikroskop potrebne komponente.

Ta izbira ohrani pripravek neobarvan, vendar spremeni razpoložljive informacije. Spremljate lahko mejo ali gibanje, ne da bi vedeli, katera molekula je ustvarila kontrast. Če vas zanima lokalizacija molekul, namesto tega izberite ustrezno metodo označevanja.

Pri jedrni DNA Invitrogenova primerjava barvil DAPI in Hoechst razlikuje med običajno uporabo DAPI pri fiksiranih celicah in bolj celično prepustnim Hoechst 33342, ki je prednostna izbira za označevanje živih celic. Obe zahtevata opremo za fluorescenco. Nobeno ni neposreden nadomestek za obarvano svetlopoljsko barvanje.

Izpostavljenost barvilu in osvetlitev obravnavajte kot eksperimentalna pogoja. Kadar merite vedenje celic, primerjajte obarvane in neobarvane pripravke.

Rdeča celica ni samodejno mrtva celica

SYTO 9 in propidijev jodid se pogosto uporabljata skupaj za ocenjevanje celovitosti bakterijske membrane. Priročnik BacLight povezuje nepoškodovane membrane z zelenim barvanjem, poškodovane membrane pa z rdečim barvanjem. Takšno razlago je treba validirati za uporabljeni vzorec.

Študija Rosenberga in sodelavcev iz leta 2019 ponazarja težavo. V 24-urnih biofilmih E. coli na steklu v fosfatnem pufru s fiziološko raztopino je bilo in situ približno 96% celic videti pozitivnih na propidijev jodid. Vendar so avtorji ocenili, da jih je bilo po odvzemu mogoče kultivirati 82%. Konfokalne slike so pokazale celice z zeleno notranjostjo pod rdeče obarvanim materialom, kar je kot vzrok zavajajočega signala nakazovalo zunajcelične nukleinske kisline.

Ti odstotki opisujejo različne meritve na pripravkih iz študije in niso univerzalni korekcijski faktor. Koristen nauk je, da je treba preveriti, kaj je ustvarilo signal. V biofilmu lahko barvilo za nukleinske kisline zazna material zunaj celic in tudi znotraj poškodovanih celic. Za sklep o viabilnosti raziskovalci priporočajo dopolnilne meritve, kot sta kultivacija ali presnovna aktivnost, pri čemer priznavajo, da ima vsaka svoje omejitve.

Preverite, kaj alternativa dejansko vsebuje

Alternativna metoda barvanja lahko še vedno vsebuje metilensko modrilo. Primer je Giemsa: Merck svoj izdelek opisuje kot raztopino azur-eozin-metilensko modrilo, namenjeno med drugim uporabi pri razmazih krvi in kostnega mozga. Lahko predstavlja drugačno metodo za drugačen vzorec, vendar ne izpolnjuje zahteve po izključitvi metilenskega modrila.

Če je izključitev določene spojine del poskusa, pred primerjanjem slik preverite identiteto in formulacijo reagenta. Vodnik o metilnem modrilu, metilenskem modrilu in podobno poimenovanih barvilih pojasnjuje razlike v poimenovanju.

Pred uporabo rezultata preverite nadomestno metodo

Pri novi metodi izvedite manjšo primerjavo z reprezentativnimi vzorci in ustrezno kontrolo. Kjer je mogoče, ohranite primerljive nastavitve mikroskopa. Zabeležite formulacijo reagenta, pripravo vzorca, izpostavljenost in pogoje slikanja, da bo mogoče raziskati vzrok za boljši videz slike, namesto da bi jo zgolj izbrali na podlagi videza.

Uspešnost ocenite glede na prvotno vprašanje. Pri morfologiji presodite, ali so meje celic in njihova razporeditev še vedno razločljive. Pri označevanju jeder ocenite lokacijo signala in ozadje. Pri viabilnosti zahtevajte dokaze, ki presegajo privlačno barvno ločitev. Širši vodnik o barvanju z metilenskim modrilom in laboratorijskih uporabah pojasnjuje, kako se opazovanje in priprava dopolnjujeta.

Izberite alternativo, ki ohrani meritev, ki jo potrebujete. Barva je le ena od lastnosti nastale slike.