Meranie mitochondriálnych účinkov metylénovej modrej: kyslík, ATP a membránový potenciál

Predstavme si, že laboratórium pridá metylénovú modrú k mitochondriám s narušenou respiráciou a zaznamená zvýšenie spotreby kyslíka. Prirodzene sa ponúka napísať, že farbivo obnovilo mitochondriálnu funkciu. Táto veta však môže byť nesprávna. Tok kyslíka, syntéza ATP a membránový potenciál sú tri odlišné pojmy. Zdieľajú tú istú organelu podobne, ako zálohovanie, synchronizácia a zdieľanie využívajú ten istý cloudový priečinok: súvisia spolu, ale riadia sa odlišnými pravidlami. Ak si jeden zameníte za druhý, interpretácia zlyhá, aj keď je každé meranie technicky správne.

Metylénová modrá takúto zámenu uľahčuje, pretože sa zapája do systému, ktorý sa meria. Je to látka podliehajúca redoxnému cyklovaniu, ktorá prijíma elektróny v skorších úsekoch reťazca a odovzdáva ich v neskorších, lipofilný katión, ktorý sa hromadí v energeticky aktívnych mitochondriách, a intenzívne modrá zlúčenina, ktorá absorbuje a vyžaruje svetlo v rovnakých pásmach ako bežné sondy. Jediný meraný ukazovateľ na to nestačí. Spoľahlivým postupom, ktorý sa uplatnil v budapeštianskych mitochondriálnych štúdiách, je merať tok kyslíka spolu s rýchlosťou syntézy ATP, membránovým potenciálom a uvoľňovaním peroxidu vodíka, pričom každý krok zahŕňa kontroly špecifické pre farbivo.

Respirometria meria tok kyslíka, nie energetický výstup

Respirometria s vysokým rozlíšením, či už pomocou Oroboros Oxygraph alebo analyzátora extracelulárneho toku Seahorse, poskytuje jednu informáciu: ako rýchlo sa redukuje kyslík. Nehovorí, koľko protónov sa prečerpalo na jeden elektrón, aká časť gradientu sa zachovala ani či ho využila ATP syntáza.

Na terminológii záleží. V izolovaných mitochondriách poskytuje substrát bez ADP respiráciu spojenú s únikom protónov, substrát so saturujúcim ADP poskytuje kapacitu oxidačnej fosforylácie a titrácia rozpojovača poskytuje maximálnu kapacitu prenosu elektrónov. V intaktných bunkách sú ekvivalentmi meranými pomocou Seahorse bazálna respirácia, respirácia viazaná na tvorbu ATP a citlivá na oligomycín, únik protónov, maximálna respirácia definovaná pomocou FCCP a nemitochondriálna spotreba kyslíka odolná voči rotenónu a antimycínu. Označovanie výstupov Seahorse ako stav 3 a stav 4 pripisuje meraniu presnosť, ktorú daný preparát neumožňuje, ako objasňuje metodický rámec Agilent Mito Stress Test.

Metylénová modrá narúša intuitívne spojenie medzi väčším množstvom kyslíka a väčším množstvom energie. V izolovaných mitochondriách mozgu morčaťa zvýšilo farbivo v koncentráciách 100 nM až 1 uM pokojovú spotrebu kyslíka pri použití glutamátu s malátom, sukcinátu a alfa-glycerofosfátu ako substrátov. Pri alfa-glycerofosfáte išlo približne o 64 percent, no respirácia stimulovaná ADP v zdravých mitochondriách sa v podstate nezmenila, ako uvádza štúdia izolovaných mozgových mitochondrií. Keďže respirácia spojená s únikom protónov vzrástla, zatiaľ čo tok stimulovaný ADP zostal nezmenený, vypočítaný pomer respiračnej kontroly klesá. Tento pokles neznamená, že farbivo poškodilo mitochondrie. Znamená, že k normálnej respirácii pridalo redoxný cyklus spotrebúvajúci kyslík. Meranie spotreby kyslíka pri metylénovej modrej, ktoré uvádza iba jej zvýšenie, zachytilo skutočnú chemickú reakciu, ale nepovedalo nič o zachovaní energie.

Experimenty zamerané na obnovu funkcie ukazujú rovnaký rozdiel vo väčšom rozsahu. Pri zablokovanom komplexe I sa tok kyslíka obnovil približne trojnásobne, zatiaľ čo syntéza ATP iba približne 1.5-násobne. K elektróde sa dostalo viac kyslíka. Menšia časť z neho prispela k tvorbe ATP. Každé tvrdenie o zlepšení oxidačnej fosforylácie potrebuje aj údaje o ATP, ideálne vyjadrené ako pomer ATP ku kyslíku s uvedením konvencie použitej pre menovateľ.

Stanovenie ATP meria rýchlosť syntézy, ktorú obsah nemôže nahradiť

Stanovenie ATP odpovedá na inú otázku: koľko ATP vzniká za jednotku času. Kinetické meranie, či už sledovanie luminiscencie luciferázy svetlušiek počas niekoľkých minút, alebo spriahnuté stanovenie pomocou hexokinázy a glukóza-6-fosfátdehydrogenázy pri 340 nm, poskytuje rýchlosť. Jednorazové meranie celkového ATP v koncovom bode poskytuje obsah, ktorý odráža syntézu mínus spotrebu a sám osebe hovorí o oxidačnej fosforylácii len málo.

Budapeštianska skupina použila spriahnutú enzymatickú metódu s potlačenou adenylátkinázou a zistila, že metylénová modrá v koncentráciách 1 až 2 uM mierne, ale významne zvýšila tvorbu ATP v mitochondriách ošetrených rotenónom a antimycínom. Ide o skutočnú, no čiastočnú obnovu funkcie. Štúdia toxicity TEGDMA priniesla podobný výsledok v inom modeli: 5 mM dentálneho monoméru TEGDMA znížilo respiráciu viazanú na komplex I z približne 286 na 28 jednotiek toku a 2 uM farbiva ju obnovilo na približne 86.

Pri farebnej redoxnej zlúčenine sú nevyhnutné dve kontroly. Po prvé, použite oligomycín na určenie toho, aká časť nameranej syntézy ATP závisí od ATP syntázy. Po druhé, vykonajte bezbunkový test výťažnosti prídavku známeho množstva ATP s kompletným činidlom a presne tými koncentráciami farbiva, ktoré sa používajú v experimente, minimálne 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM a 2 uM. Farbivo môže absorbovať vyžarované svetlo, inhibovať reportérový enzým alebo meniť redoxnú chémiu činidla. Všeobecné odporúčania pre luciferázové testy odporúčajú doplnkové biochemické kontrolné testy práve pre tento typ interferencie. Nepredpokladajte, že pri 1 uM nevznikajú artefakty len preto, že zhášanie býva výraznejšie pri vyšších koncentráciách.

Sondy membránového potenciálu merajú distribúciu farbiva, nie tok

Safranín O, TMRM a TMRE, rodamín 123 a JC-1 sú katióny schopné prechádzať cez membránu. Podľa elektrochemickej rovnováhy sa hromadia v záporne nabitej matrix, takže celková fluorescencia nepriamo informuje o potenciáli prostredníctvom polohy sondy. Žiadna z nich nemeria ATP ani tok elektrónov.

Každá sonda je vhodná pre určitý preparát. Safranín O sa hodí pre izolované mitochondrie a permeabilizované bunky, zvyčajne pri koncentrácii okolo 2 uM, s excitáciou okolo 495 nm a emisiou okolo 585 nm. Pracuje v režime zhášania, v ktorom príjem sondy mení celkovú fluorescenciu. TMRM a TMRE sú vhodné pre intaktné bunky pri nízkom nanomolárnom zaťažení v režime bez zhášania, v ktorom depolarizácia uvoľňuje farbivo a mitochondriálna fluorescencia klesá; pri vysokom zaťažení sa môže smer signálu obrátiť v dôsledku samozhášania. JC-1 poskytuje praktický pomer zelenej a červenej fluorescencie, ale závisí od zaťaženia sondou a mitochondriálnej hmoty, takže je na kvantitatívnu prácu menej vhodný než starostlivo kontrolované TMRM. Tieto kompromisy sumarizuje široko používaný prehľad sond mitochondriálneho membránového potenciálu.

Metylénová modrá spôsobuje optickú interferenciu práve pri pracovných koncentráciách. Jej absorpčné pásma okolo 600 až 665 nm sa prekrývajú s červenou emisiou sond, takže efekty vnútorného filtra, zhášanie aj absorpcia excitačného svetla sú reálnymi možnosťami. Farbivo je navyše ďalším lipofilným katiónom, ktorého vlastná distribúcia sa mení s meraným potenciálom. Obranou sú nezávislé overenia a slepé vzorky: samotná sonda, samotné farbivo, sonda s každou koncentráciou farbiva, úplná depolarizácia pomocou FCCP ako nulová referencia a ideálne druhá, opticky odlišná sonda. Štúdia obídenia komplexu III zaviedla tento postup tým, že po inhibícii antimycínom a myxotiazolom zopakovala meranie obnovy membránového potenciálu pomocou safranínu O aj TMRM a získala rovnakú kvalitatívnu obnovu. Jeden optický reportér je náznak. Dva nezávislé reportéry sú dôkaz.

Tri preparáty, tri odlišné otázky

Izolované mitochondrie, permeabilizované bunky a intaktné bunky nie sú zameniteľné nastavenia citlivosti jedného testu. Predstavujú odlišné prístupy s odlišnými princípmi fungovania.

Izolované mitochondrie zachovávajú elektrónový transportný reťazec, vnútornú membránu a molekulárny aparát matrix, pričom odstraňujú plazmatickú membránu, cytosol a architektúru siete. Práve toto odstránenie je ich zmyslom: substráty, ADP, inhibítory a koncentrácie farbiva sú presne definované, takže možno určiť konkrétnu dráhu. Cenou je strata prirodzeného prísunu substrátov, signalizácie a energetického dopytu.

Permeabilizované bunky zachovávajú mitochondrie vo veľkej časti ich bunkovej architektúry, pričom umožňujú exogénnym substrátom a ADP prenikať cez otvorenú plazmatickú membránu. Sú vhodným nástrojom na priradenie poruchy ku konkrétnej substrátovej dráhe v bunkovom kontexte. Nadmerná permeabilizácia poškodzuje vonkajšiu membránu a cytosolová regulácia sa vyplavuje.

Intaktné bunky zachovávajú všetko: bariéru plazmatickej membrány, cytosolové redukčné látky, endogénny transport substrátov, mitochondriálnu sieť a dopyt po ATP. Sú najbližšie k fyziológii a najďalej od mechanizmu, pretože príjem, redukcia aj sekvestrácia farbiva ovplyvňujú jeho účinnú expozíciu v mitochondriách.

Štúdia TEGDMA zámerne použila všetky tri úrovne: izolované mozgové mitochondrie na sledovanie obnovy oxidácie a potenciálu pôsobením farbiva, permeabilizované kmeňové bunky zubnej drene najmä na lokalizáciu poruchy do oxidácie substrátov viazanej na komplex I a intaktné kmeňové bunky na sledovanie celkového fyziologického účinku 2 uM farbiva na potlačenú spotrebu kyslíka. Čitateľom, ktorí porovnávajú mitochondriálne ukazovatele medzi preparátmi, poskytuje sprievodný vysvetľujúci článok o tom, ako metylénová modrá prenáša elektróny cez dýchací reťazec, základný prehľad dráh. Sprievodca čítaním štúdií respirácie s metylénovou modrou sa venuje logike použitých dávok a inhibítorov.

Kontroly, ktoré si vyžaduje redoxne aktívne farbivo

Látka podliehajúca redoxnému cyklovaniu potrebuje dlhší zoznam kontrol než bežný inhibítor, pretože chemické reakcie samotného farbiva môžu napodobňovať biologické deje.

Pri respirometrii použite komoru iba s pufrom na kontrolu driftu, komoru s pufrom a farbivom bez biologického materiálu, farbivo s každou extracelulárnou redukčnou látkou prítomnou v teste a na záver rotenón s antimycínom na určenie nemitochondriálnej spotreby kyslíka v intaktných bunkách. Upozorňujeme, že redukované farbivo sa znovu oxiduje prenosom elektrónov na kyslík za vzniku peroxidu vodíka. Slepá vzorka iba s farbivom bez donora elektrónov preto podhodnocuje bezbunkovú spotrebu kyslíka, ktorá sa objaví po sprístupnení NADH alebo NADPH.

Pri peroxide vodíka uprednostnite kalibrovaný Amplex UltraRed s chrenovou peroxidázou pred neselektívnymi farbivami DCFDA, overte výsledok katalázou a otestujte závislosť od osvetlenia, keďže farbivo je fotosenzibilizátor. Štúdia mozgových mitochondrií zistila, že peroxidová záťaž vzrástla viac než štvornásobne už pri 100 nM farbiva, zatiaľ čo eliminácia sa spomalila. Peroxid pritom vznikal priamo pôsobením redukovaného farbiva bez superoxidového medziproduktu. Podrobnosti o výbere sondy a kontrolách osvetlenia nájdete v sprievodnom článku o meraní reaktívnych foriem kyslíka v experimentoch s farbivami. Širšia otázka, kedy peroxid pôsobí ako signál a kedy ako záťaž, sa rozoberá spolu s bunkovou redoxnou rovnováhou a tvrdeniami o antioxidantoch.

Pri tvrdeniach o dráhach otestujte obe inhibičné miesta komplexu III: antimycín A na mieste Qi a myxotiazol na mieste Qo, a pridajte aj koncový test komplexu IV s kyanidom. Skoršia štúdia mozgu myší uvádzala obnovu respirácie pôsobením farbiva po zablokovaní rotenónom, ale nie antimycínom. Neskoršia štúdia na troch druhoch však zistila čiastočnú obnovu pri oboch inhibítoroch a dôkazy priamej redukcie cytochrómu c. Obídenie reťazca preto považujte za zlučiteľné s novšími údajmi, nie za definitívne objasnené, pretože koncentrácia farbiva, miesto pôsobenia inhibítora, stav substrátov a distribúcia farbiva menia pozorovanú dráhu.

Matica výberu metód

Pomocou tejto tabuľky vyberajte meranie podľa otázky, nie naopak.

Na minimálne presvedčivé tvrdenie treba pri rovnakých koncentráciách farbiva, 100 nM, 300 nM, 1 uM a 2 uM, zmerať tok kyslíka v podmienkach úniku protónov, s ADP, s oligomycínom a s rozpojovačom, rýchlosť syntézy ATP, membránový potenciál ideálne pomocou dvoch sond a kalibrované uvoľňovanie peroxidu s katalázou a bezbunkovými kontrolami. Uveďte prepojený súbor výsledkov: tok kyslíka spolu s rýchlosťou tvorby ATP, ATP na kyslík, potenciálom a peroxidom. Ktorékoľvek z týchto čísel samo osebe je meraním, ktoré ešte len hľadá svoj význam.