Metylénová modrá a stukovatenie pečene: čo zistili experimentálne štúdie

Stukovatenie pečene je spoločné označenie pre niekoľko odlišných problémov. U jedného človeka je spúšťačom dlhodobá nadmerná konzumácia alkoholu. U iného je to nadmerný prísun živín s inzulínovou rezistenciou a zvýšeným prísunom tuku do pečene. Pod mikroskopom môže byť v oboch prípadoch viditeľné jednoduché ukladanie tuku, no prvotné príčiny sa líšia. Tento rozdiel určuje, čo môže daný experiment preukázať.

Literatúra o metylénovej modrej a stukovatení pečene je obmedzená a v tejto otázke výlučne predklinická. Najčastejšie sa citujú tri štúdie na potkanoch a myšiach, no ich výsledky neukazujú rovnakým smerom. Jedna štúdia s podávaním etanolu upravila redoxný posun, ale množstvo tuku v pečeni zostalo nezmenené. Jedna štúdia so stravou s vysokým obsahom tuku zaznamenala zníženie tuku v pečeni spolu so zmenou signalizácie. Jedna štúdia na zdravých zvieratách zistila opačné výsledky peroxidácie lipidov v pečeni a obličkách. Spoločne ukazujú, prečo treba odlišovať tri sledované ukazovatele: redoxnú zmenu, aktiváciu signalizácie a hromadenie tuku v tkanive.

Tri ukazovatele, ktoré sa ľahko zamieňajú

Redoxný ukazovateľ opisuje nakladanie s elektrónmi. Pomer NAD+ k NADH v pečeni ukazuje, či je bunkové prostredie relatívne oxidované alebo redukované. Oxidácia etanolu premieňa NAD+ na NADH, takže chronické pitie tento pomer znižuje. Farbivo, ktoré prijíma elektróny, ho môže opäť zvýšiť. Ide o chemický dej, nie o dôkaz menšieho množstva uloženého tuku.

Ukazovateľ signalizácie opisuje reguláciu. SIRT1 je regulačný enzým závislý od NAD+, ktorý modifikuje proteíny zapojené do funkcie mitochondrií a metabolizmu lipidov. AMPK funguje ako senzor nízkej energetickej dostupnosti; po aktivácii podporuje oxidáciu energetických substrátov a obmedzuje syntézu lipidov. Keď článok uvádza aktiváciu SIRT1 v pečeni pôsobením metylénovej modrej, opisuje regulačný posun. Zatiaľ však neuvádza výsledok u pacienta.

Histologický alebo biochemický ukazovateľ opisuje samotnú pečeň. Bežnými príkladmi sú obsah triglyceridov na gram tkaniva, farbenie neutrálneho tuku pomocou Oil Red O, hodnotenie balónovitého zväčšenia buniek a poškodenia farbením hematoxylínom a eozínom a aktivita ALT v plazme. Iba táto tretia skupina odpovedá na otázku, či sa v danom experimente pri použití metylénovej modrej zlepšila steatóza pečene.

Rozlišovanie týchto skupín predchádza najčastejšiemu nesprávnemu výkladu: priaznivý redoxný alebo signalizačný výsledok neznamená menšie stukovatenie pečene.

Etanolový model: redoxný stav upravený, tuk nezmenený

Najjednoznačnejšie negatívne zistenie pochádza zo štúdie s chronickým podávaním etanolu v potrave samcom potkanov Wistar. Zvieratá dostávali etanol ako súčasť tekutej stravy, pričom jeho podiel postupne dosiahol 36 percent celkového energetického príjmu. Kontrolné zvieratá s rovnakým príjmom potravy dostávali namiesto energie z etanolu glukózu. Jedna etanolová skupina a jedna kontrolná skupina zároveň dostávali od 5. do 30. dňa metylénovú modrú v množstve 130 mg na liter stravy, približne 42 mg na kg denne.

Redoxný stav sa odhadoval pomocou štandardných dvojíc metabolitov: pomeru laktátu k pyruvátu pre cytosol a 3-hydroxybutyrátu k acetoacetátu pre mitochondrie. V počiatočnej fáze podávania vysokých dávok etanolu sa v etanolových skupinách objavili výrazné posuny: cytosolový pomer NAD+ k NADH klesol približne o 62 percent a mitochondriálny približne o 71 percent, pričom sa zvýšila aj hladina glycerol-3-fosfátu. Metylénová modrá tieto posuny do veľkej miery zvrátila a vrátila hladinu glycerol-3-fosfátu blízko ku kontrolným hodnotám bez zmeny príjmu etanolu, prírastku telesnej hmotnosti či hladiny etanolu v sére.

Tuk v pečeni však ukázal iný obraz. Na 12. deň, pred výrazným nahromadením tuku, sa obsah triglyceridov medzi skupinami nelíšil. Na 27. deň mali etanolové skupiny výrazne zvýšený obsah triglyceridov bez ohľadu na metylénovú modrú. Na 30. deň sa u zvierat dostávajúcich etanol zvýšil celkový obsah lipidov približne o 89 percent a obsah triglyceridov približne o 196 percent, opäť bez vplyvu farbiva. Centrilobulárna tuková infiltrácia vyzerala rovnako s podávaním aj bez podávania metylénovej modrej. Autori dospeli k záveru, že redoxný posun vyvolaný etanolom nie je v tomto modeli hlavnou príčinou stukovatenia pečene po dlhodobom podávaní. Pomáha tu rozlišovať, ako sa zistenia zo zvieracích a bunkových štúdií premietajú do rizika u ľudí: mechanizmus môže byť skutočný, a predsa nemusí určovať výsledok.

Túto štúdiu treba citovať, keď niekto tvrdí, že každá úprava redoxného stavu musí odstrániť tuk z pečene. V tomto usporiadaní experimentu sa to nestalo.

Metabolický model: signalizácia a menej tuku u myší

Iný obraz prináša štúdia na hepatocytoch a myšiach so stravou s vysokým obsahom tuku, zameraná na SIRT1 a AMPK. V bunkách HepG2, bunkách AML-12 a primárnych hepatocytoch potkanov metylénová modrá zvýšila pomer NAD+ k NADH, zvýšila množstvo proteínu SIRT1, znížila acetyláciu regulátora PGC-1alpha, zvýšila obsah mitochondriálnej DNA a spotrebu kyslíka a aktivovala AMPK s následným zvýšením CPT-1 a PPARalpha. Keď sa potlačila expresia SIRT1, aktivácia AMPK sa stratila, čo v tomto bunkovom systéme spája uvedený reťazec so SIRT1. Farbivo tiež pôsobilo proti lipogénnym signálom vyvolaným agonistom LXR T0901317 a vystavením palmitátu vrátane indukcie SREBP-1c, FAS a ACC.

Zvieracia časť štúdie využívala samce myší C57BL/6, ktoré 8 týždňov dostávali stravu so 60 percentami tuku. Počas posledných 4 týždňov sa im štyrikrát týždenne perorálne podávala metylénová modrá v dávke 3 alebo 10 mg na kg denne. Myši, ktorým bola podávaná, vykazovali menší rozsah farbenia Oil Red O, nižší obsah triglyceridov v pečeni, menej balónovitého zväčšenia buniek a tukovej degenerácie pri histologickom vyšetrení a nižšiu plazmatickú ALT než myši na rovnakej strave bez podávania metylénovej modrej. Farmakokinetická časť tej istej práce zistila perorálnu biologickú dostupnosť približne 31 až 35 percent pri takmer úplnom vstrebávaní z čreva, ale výraznom metabolizme. Najvyšší pomer koncentrácie v tkanive ku koncentrácii v plazme bol v pečeni, takže účinok v pečeni je prinajmenšom vierohodný z hľadiska distribúcie.

Ide o skutočný signál zníženia steatózy, no jeho platnosť má úzke hranice. Je to krátky experiment na myšiach s 9 až 10 zvieratami v skupine, jedným typom stravy, dvoma dávkami a štyrmi týždňami podávania. Skúma metabolickú steatózu a znaky steatohepatitídy, nie ochorenie súvisiace s alkoholom, a nehodnotí cirhózu, zvrátenie fibrózy ani žiadny výsledok u ľudí. Mitochondriálne a redoxné ukazovatele pri výklade takýchto výsledkov slúžia ako podpora hypotézy, nie ako podklad pre dávku alebo postup podávania.

Pohľad na zdravé tkanivo: rovnaká dávka, opačné výsledky v orgánoch

Tretia štúdia sa často používa na podporu tvrdení o pečeni, hoci na to nie je vhodná. V 30-dňovom experimente na zdravých samiciach potkanov Wistar dostávalo päť zvierat 1 mM metylénovú modrú v pitnej vode a päť slúžilo ako kontrolná skupina. Superoxiddismutáza, kataláza a redukovaný glutatión sa v pečeni ani obličkách nezmenili. Peroxidácia lipidov sa v pečeni mierne zvýšila a v obličkách klesla. Sérová ALT a kreatinín klesli, pričom dusík močoviny v krvi sa nezmenil.

Korektným výkladom je tkanivová špecifickosť u zdravých zvierat, nie liečba ochorenia. Rovnaká expozícia sa podľa jedného ukazovateľa javila v pečeni ako mierne prooxidačná a v obličkách podľa toho istého ukazovateľa ako mierne ochranná, zatiaľ čo štandardné antioxidačné obranné mechanizmy zostali nezmenené. Pri piatich zvieratách v skupine a bez modelu ochorenia táto práca varuje pred označovaním metylénovej modrej za všeobecný antioxidant pre pečeň. Ukazuje tiež, prečo zmeny pečeňových enzýmov potrebujú jasne vymedzený kontext ochorenia, aby sa dali považovať za zlepšenie.

Porovnanie troch experimentov na pečeni

Tabuľka jasne ukazuje hlavný záver. Podobné modré farbivo, odlišná biológia. Etanolová štúdia oddeľuje úspešnú úpravu redoxného stavu od neúspechu pri znížení tuku. Štúdia so stravou spája signalizáciu a zlepšenie množstva tuku v jednom modeli. Štúdia na zdravých zvieratách ukazuje, že redoxné ukazovatele sa môžu v rôznych orgánoch meniť opačnými smermi.

Prečo z toho nevyplýva tvrdenie o liečbe

Žiadna z týchto štúdií nezahŕňala ľudí so stukovatením pečene. Dávky, spôsoby podávania a dĺžka podávania sa medzi prácami líšia a nemožno ich jednoduchým prepočtom previesť na režim pre človeka. Malé skupiny, najmä tri zvieratá na každý časový bod redoxných meraní v etanolovej štúdii a päť zvierat v skupine v štúdii na zdravých zvieratách, ponechávajú značnú neistotu. Líšia sa aj pohlavie, kmeň, zloženie stravy a načasovanie podávania vo vzťahu k poškodeniu. Navyše oba modely ochorenia predstavujú odlišné prvotné príčiny, takže pozitívny výsledok pri strave nemôže napraviť negatívny výsledok pri etanole ani naopak.

Pre každého s diagnostikovaným ochorením pečene je dôležitejšie čítať tieto zistenia z hľadiska opatrnosti než liečby. Prehľad bezpečnostných opatrení pri metylénovej modrej v súvislosti s obličkami a pečeňou vysvetľuje, prečo porucha funkcie orgánov mení otázky bezpečnosti, aj keď štúdia na zvieratách vyzerá priaznivo. Prineste lekárovi informácie o diagnóze, najnovšie laboratórne výsledky, presný výrobok a spôsob podávania a úplný zoznam liekov. Opýtajte sa, aké dôkazy podporujú použitie daného výrobku na daný účel u človeka s takýmto stupňom poruchy funkcie.

Záver: metylénová modrá v jednom etanolovom modeli zmenila redoxný stav pečene bez zníženia uloženého tuku, v jednom myšacom metabolickom modeli aktivovala SIRT1 a AMPK a zároveň znížila množstvo tuku a u zdravých potkanov vykazovala redoxné účinky špecifické pre jednotlivé orgány. Ide o súbor podnetov na výskum, nie o overenú liečbu stukovatenia pečene.