Metylénová modrá a oxid dusnatý: NOS, cGMP a cievna signalizácia

Otázka znie jednoducho: inhibuje metylénová modrá oxid dusnatý? V laboratóriu sa však odpoveď rozdeľuje na štyri samostatné otázky a každá si vyžaduje iné experimentálne overenie. Ich zamieňanie je hlavným dôvodom, prečo texty o metylénovej modrej a oxide dusnatom pôsobia sebaisto, no neurčito.

Predstavte si signál oxidu dusnatého ako reťaz so štyrmi článkami. Gén sa transkribuje, aby vznikla syntáza oxidu dusnatého. Enzým premieňa arginín na oxid dusnatý. Plyn difunduje k svojmu cieľu skôr, než zreaguje s niečím iným. Rozpustná guanylátcykláza ho zachytí a vytvorí cyklický GMP. Pri každom článku boli publikované účinky metylénovej modrej, ale dôkazy pochádzajú z rôznych experimentálnych systémov, rôznych koncentrácií a rôznych izoforiem. Výsledok pri jednom článku nedokazuje pôsobenie na iný.

Základná reťaz, vysvetlená jednoducho

V stene cievy prebieha štandardná postupnosť takto. Podnet pôsobí na endotelovú bunku. Endotelová syntáza oxidu dusnatého, označovaná ako eNOS alebo NOS3, vytvorí malý impulz oxidu dusnatého. Plyn difunduje do susednej bunky hladkého svalstva, naviaže sa na hém s redukovaným železom v rozpustnej guanylátcykláze a urýchli premenu GTP na cyklický GMP. Cyklický GMP aktivuje proteínkinázu G, zmení sa hospodárenie s vápnikom a sval sa uvoľní.

Existuje aj druhá reťaz, ktorú treba posudzovať oddelene. Počas infekcie alebo pôsobenia cytokínov bunky transkribujú iný enzým, inducibilnú syntázu oxidu dusnatého čiže iNOS, označovanú aj ako NOS2. Produkuje väčšie a dlhšie trvajúce toky oxidu dusnatého než eNOS. Tretia izoforma, neurónová NOS čiže nNOS, patrí do ďalšieho odlišného kontextu. Keď článok uvádza syntázu oxidu dusnatého bez určenia izoformy, zastavte sa a overte, ktorá bola meraná. Prehľad toho, ako metylénová modrá prenáša elektróny, zdôrazňuje rovnaký princíp aj pre redoxné ciele všeobecne: samotný prenos nič nevykoná a výsledok určuje partner na každom konci.

Aj nameraný cyklický GMP je súhrnným ukazovateľom, nie priamym testom enzýmu. Jeho hladina odráža syntézu cyklázou mínus rozklad fosfodiesterázami, najmä PDE5 v hladkom svalstve ciev. Pokles cyklického GMP teda znamená, že k detektoru dorazilo menej signálu. Sám osebe však neurčuje, ktorý článok zlyhal.

Článok 1: tvorí sa menej enzýmu iNOS

V myších makrofágoch stimulovaných bakteriálnym lipopolysacharidom, interferónom gama alebo oboma metylénová modrá zabránila očakávanému nárastu proteínu iNOS a výrazne potlačila mediátorovú RNA iNOS v experimentoch s transkripciou v makrofágoch. Výpovedné je najmä to, čo sa nezmenilo. Degradácia inhibítora I kappa B alfa, fosforylácia NF kappa B a STAT1 aj presun týchto faktorov do jadra zostali prevažne zachované. Znížila sa ich väzba na DNA, čo potvrdila chromatínová imunoprecipitácia preukazujúca menšie obsadenie promótora iNOS.

Ide o účinok na reguláciu génu, ktorý predchádza zmene množstva enzýmu, nie o akútnu blokádu už existujúceho enzýmu. Patrí do zápalovej signalizácie, pri ktorej sa transkripčné faktory musia naviazať na promótor skôr, než vznikne proteín. Nehovorí nič priamo o konštitutívnej eNOS v cieve v pokojovom stave a mal by sa opisovať práve v tomto kontexte.

Článok 2: existujúci enzým NOS pracuje pomalšie

Štúdia na potkanoch skúmala inú úroveň. Samcom potkanov pri vedomí bol intravenózne podaný lipopolysacharid a o tri hodiny neskôr buď fyziologický roztok, alebo metylénová modrá v množstve 3 mg na kg intravenózne. Aktivita syntázy oxidu dusnatého v mediobazálnom hypotalame sa merala premenou značeného arginínu na citrulín v štúdii aktivity NOS v hypotalame. Samotný stres spolu s fyziologickým roztokom vyvolal určitú aktivitu nezávislú od vápnika a lipopolysacharid ju zvýšil približne na desaťnásobok kontrolnej hodnoty. Metylénová modrá odstránila obe vyvolané zložky. Konštitutívna aktivita závislá od vápnika sa v tomto tkanive pri danej dávke a v danom časovom bode nezmenila.

Tento výsledok čítajte presne tak, ako je uvedený: za daných podmienok bola potlačená nameraná aktivita typu iNOS. Nejde o meranie génovej expresie ani o dôkaz trvalej selektivity pre iNOS oproti eNOS alebo nNOS. Práca s purifikovanými enzýmami túto potrebu opatrnosti ešte zdôrazňuje. V priamych testoch purifikovanej syntázy oxidu dusnatého metylénová modrá úplne zablokovala tvorbu citrulínu pri koncentrácii 30 mikromolárnej, pričom koncentrácia spôsobujúca polovičnú inhibíciu bola približne 5.3 mikromolárna bez superoxiddismutázy a 9.2 mikromolárna s ňou, ako uvádza porovnanie purifikovanej NOS a guanylátcyklázy. Samostatná štúdia purifikovanej nNOS poukázala na účasť oxidácie hému viazaného na enzým. Praktické poučenie je, že priama inhibícia NOS v izolovaných systémoch skutočne existuje, no výsledok z hypotalamu nemožno rozšíriť na všeobecné tvrdenie, že metylénová modrá všade ponecháva všetky konštitutívne NOS nedotknuté.

Článok 3: oxid dusnatý sa stráca skôr, než dorazí

Najjasnejší dôkaz, že pokles cyklického GMP môže vysvetliť aj niečo iné než blokáda enzýmu, pochádza z kultivovaných buniek hladkého svalstva pľúcnej artérie králika. Experiment úplne obišiel endogénnu NOS priamym pridaním donorov oxidu dusnatého a následne skúmal, či metylénová modrá aj tak potlačí odpoveď cyklického GMP v štúdii superoxidu v hladkom svalstve ciev.

Testovali sa tri donory v koncentráciách od 1 do 100 mikromolárnych: S-nitrózo-L-cysteín, nitroprusid sodný a stabilný deaminovaný analóg nazývaný MPANO. Všetky zvýšili cyklický GMP približne na 1.5-násobok až 12-násobok. Metylénová modrá pri koncentrácii 10 mikromolárnej inhibovala odpovede na prvé dva o 51 až 100 percent a odpoveď na MPANO ponechala nezmenenú. Ak by metylénová modrá jednoducho blokovala katalytické miesto cyklázy, túto selektivitu voči donorom by bolo ťažké vysvetliť, pretože všetky tri pôsobia na rovnaký enzým v ďalšej časti dráhy.

Tri kontrolné experimenty potom spojili mechanizmus so superoxidom. Po prvé, tvorba extracelulárneho superoxidu pomocou xantínu a xantínoxidázy reprodukovala rovnaký vzorec: CYSNO a nitroprusid boli blokované, MPANO zostal nedotknutý. Po druhé, metylénová modrá vyvolala v bunkách hladkého svalstva tvorbu superoxidu závislú od dávky a času, meranú redukciou cytochrómu c. Po tretie, superoxiddismutáza inhibícii úplne zabránila, zatiaľ čo kataláza nie, čo v tomto experimentálnom systéme poukazuje na superoxid, nie na peroxid vodíka, ako na bezprostredne pôsobiacu chemickú formu.

Za zmienku stojí aj verzia experimentu so spoločnou kultiváciou, pretože priestorovo lokalizuje účinok. Endotelové bunky na krycích sklíčkach sa krátko spoločne kultivovali s bunkami hladkého svalstva, takže bazálne uvoľňovaný endotelový faktor zvýšil cyklický GMP v hladkom svalstve na trojnásobok až osemnásobok. Predbežné ošetrenie ktoréhokoľvek z týchto dvoch kompartmentov metylénovou modrou tento signál znížilo a superoxiddismutáza čiastočne zvrátila účinok predbežného ošetrenia endotelu. Inými slovami, metylénová modrá vôbec nemusí pôsobiť vnútri bunky hladkého svalstva, ktorá signál zachytáva. Môže signál oslabiť tým, že odstráni posla počas jeho presunu. Sprievodca čítaním výskumu metylénovej modrej to považuje za všeobecné pravidlo: skôr než určíte molekulový cieľ, pomenujte kompartment, v ktorom zásah prebehol.

Nazývať to inhibíciou NOS by bolo nesprávne. Na pôsobenie donorov nebol potrebný žiadny krok zahŕňajúci syntázu, a napriek tomu signál klesol.

Článok 4: samotný detektor reaguje slabšie

Priame účinky na rozpustnú guanylátcyklázu existujú, ale záleží na koncentráciách. Vo vyššie citovanom porovnaní purifikovaných enzýmov potrebovala cykláza stimulovaná oxidom dusnatým na polovičnú inhibíciu metylénovú modrú v koncentrácii približne 60 mikromolárnej, zatiaľ čo pri NOS nastala polovičná inhibícia približne pri 5 až 9 mikromolárnych. Aj koncentrácia 1 milimolárna vyvolala iba čiastočnú maximálnu blokádu. Ide približne o šesťnásobný až jedenásťnásobný rozdiel. Bunkový experiment s nízkymi mikromolárnymi koncentráciami, pri ktorom klesne cyklický GMP, preto nemožno označiť za selektívnu inhibíciu cyklázy iba na základe hodnoty cyklického GMP.

Neskoršia redoxná štúdia pridala ďalší dôvod na opatrnosť: metylénová modrá deaktivovala cyklázu aktivovanú oxidom dusnatým mechanizmom odlišným od jednoduchej oxidácie hémového železa vzduchom. Detektor teda môže byť narušený, no príslušná chémia zatiaľ nie je objasnená. Rozdiel v koncentráciách navyše znamená, že pri pôsobení nízkych mikromolárnych koncentrácií treba najprv vylúčiť účinky superoxidu a NOS. Sem patrí aj kontrola fosfodiesteráz. Ak sa rozklad nemeral alebo neblokoval, znížené hromadenie cyklického GMP môže zodpovedať menšej syntéze, rýchlejšiemu rozkladu alebo obom.

Prečo to nemožno zredukovať na jedno tvrdenie o krvnom tlaku

Každý článok bol preukázaný v inom systéme. Transkripcia v makrofágoch nie je enzýmová aktivita v hypotalame. Aktivita v hypotalame po lipopolysacharide nie je pokojový endotelový tonus. Bazálne uvoľňovaný endotelový faktor v spoločnej kultúre nie je vazodilatácia stimulovaná agonistom. Kultivované bunky pľúcnej artérie pri koncentrácii metylénovej modrej 10 mikromolárnej nie sú ľudský krvný obeh. Zhrnutie všetkého do tvrdenia, že metylénová modrá zvyšuje krvný tlak blokovaním oxidu dusnatého, zahadzuje práve tie rozdiely, na zachovanie ktorých boli kontrolné experimenty navrhnuté.

Tri overenia pomáhajú zachovať presnosť výkladu. Po prvé, pomenujte izoformu: eNOS pre pokojový cievny tonus, iNOS pre indukovaný tok pri zápale, nNOS pre neurónové súvislosti a niektoré experimenty s purifikovanými enzýmami. Po druhé, pomenujte spôsob prenosu signálu oxidu dusnatého: endogénna syntéza, bazálne uvoľňovanie z endotelu alebo konkrétny donor, napríklad CYSNO, nitroprusid či MPANO, pretože stabilný donor pôsobeniu metylénovej modrej odolal, zatiaľ čo labilné nie. Po tretie, uveďte koncentráciu a spôsob obnovenia odpovede: obnovenie pomocou superoxiddismutázy poukazuje na superoxid, neúčinnosť katalázy svedčí proti peroxidu vodíka v danom experimentálnom systéme, napodobnenie účinku xantínoxidázou ukazuje, že tento mechanizmus postačuje, a testy purifikovaných enzýmov oddeľujú priame účinky na katalýzu od strát počas presunu.

Stručné zhrnutie je takéto. Metylénovú modrú je vhodnejšie chápať ako látku zasahujúcu na viacerých miestach do signalizácie od oxidu dusnatého po cyklický GMP než ako selektívny blokátor cyklázy. V závislosti od experimentálneho systému a koncentrácie môže obmedziť väzbu transkripčných faktorov iNOS, priamo inhibovať enzýmy NOS, znížiť dostupnosť oxidu dusnatého tvorbou superoxidu a narušiť cyklázu aktivovanú oxidom dusnatým. Úloha signalizácie cyklického GMP v cievnych štúdiách a porovnanie donorov oxidu dusnatého používaných v bunkových testoch sa podrobnejšie venujú jednotlivým vetvám. Metódy používané na oddelenie redoxných účinkov od účinkov na enzýmy vysvetľujú, prečo sa v tejto literatúre tak často objavuje superoxiddismutáza spolu s katalázou a kontrolou so stabilným donorom.

Nízka hodnota cyklického GMP po metylénovej modrej odhaľuje prerušenú reťaz. Iba kontrolné experimenty ukážu, ktorý článok sa prerušil.