Prečo sa metylénová modrá používa na kontrastné farbenie pri dôkaze acidorezistencie

Laborant skúma náter spúta po dokončení celého postupu farbenia. Na modrom pozadí vynikajú červené tyčinky a výsledok sa vydáva ako nález acidorezistentných bacilov. Na druhý deň iné podložné sklíčko ukazuje rovnomerne modré pole bez červených tyčiniek a výsledok sa označí ako negatívny na tuberkulózu. Jeden z týchto výsledkov tvrdí viac, než nález na sklíčku umožňuje, a nie je to ten prvý.

Nedorozumenie spočíva v chápaní princípu. Laborant považoval modré farbivo za súčasť detekčnej chémie, akoby metylénová modrá pomáhala nájsť mykobaktérie. Nepomáhala. Keď sa metylénová modrá dostane na sklíčko, skúška už prebehla. Farbivo iba zafarbí pozadie, aby bol výsledok čitateľný. Tento článok vysvetľuje úlohu metylénovej modrej pri farbení na dôkaz acidorezistencie, prečo sa používa modrá a nie iná farba a aké závery možno vyvodiť z červenej na modrom pozadí.

Stručná odpoveď

Farbenie na dôkaz acidorezistencie je diferenciačná skúška založená na troch princípoch. Karbolfuchsín, primárne farbivo, sa nútene dostáva do každej bunky vrátane mykobaktérií s voskovitým obalom. Kyslý alkohol, odfarbovací roztok, odstraňuje červené farbivo z bežných buniek, ale z acidorezistentných buniek ho nedokáže extrahovať. Metylénová modrá, kontrastné farbivo, následne zafarbí všetko, z čoho odfarbovací roztok odstránil farbivo. Neacidorezistentné bunky, bunky hostiteľa a bunkové zvyšky sa preto javia modré, zatiaľ čo acidorezistentné bacily zostávajú červené. Kontrastné farbivo zabezpečuje kontrast. Nijako sa nepodieľa na chemických vlastnostiach, ktoré bunke dávajú acidorezistenciu.

Čo robí každý krok

Nasledujúca schéma ukazuje rozdelenie úloh. Čítajte ju zľava doprava ako postup a spodný pás ako pripomienku, že každá skupina farbiacich metód odpovedá na inú otázku.

Prvým krokom je prenikanie farbiva. Mykobaktérie odolávajú bežným vodným farbivám, pretože ich obal je nezvyčajne hydrofóbny, a preto protokol zabezpečuje vynútený prienik. Pri Ziehlovej-Neelsenovej metóde zahrievanie až do tvorby pár napomáha prenikaniu karbolfuchsínu obsahujúceho fenol cez voskovitú stenu. Pri Kinyounovej metóde za studena sa teplo nahrádza oveľa koncentrovanejšou formuláciou primárneho farbiva a niektoré modifikované verzie bez zahrievania pridávajú povrchovo aktívne látky. Protokoly farbenia na dôkaz acidorezistencie Americkej spoločnosti pre mikrobiológiu uvádzajú obe formulácie vedľa seba a rozdiel v koncentrácii je výrazný: približne 0.3 g bázického fuchsínu na 100 mL pri metóde so zahrievaním oproti približne 4 g pri metóde za studena.

Druhým krokom je diferenciácia. Kyslý alkohol, bežne 3 mL koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej v 97 mL 95-percentného etanolu, vymýva červené farbivo z každej bunky, ktorej stena nekladie osobitný odpor. Bunky s neporušeným mykobakteriálnym lipidovým obalom si farbivo ponechajú. Od tohto kroku závisí celá metóda a zároveň je najcitlivejší na techniku vykonania, ako sa uvádza nižšie.

Posledným krokom je kontrast. Na sklíčku sú teraz červené acidorezistentné bunky na takmer bezfarebnom pozadí odfarbených buniek. Metylénová modrá v koncentrácii 0.3 percenta w/v obnoví viditeľnosť tohto pozadia farbou, ktorá sa od červenej čo najviac odlišuje. Kontrastné dofarbenie je krátke, zvyčajne 20 až 30 sekúnd pri metóde so zahrievaním a až niekoľko minút pri niektorých variantoch metódy za studena. Čas závisí od protokolu, nie od samotných vlastností farbiva.

Prečo práve toto farbivo a prečo modrá

Metylénová modrá je katiónové bázické farbivo, čo znamená, že jej farebný ión má kladný náboj a viaže sa na záporne nabité povrchy odfarbených baktérií, buniek hostiteľa a bunkových zvyškov. OpenStax Microbiology opisuje tento princíp nábojov ako všeobecný základ fungovania bázických farbív. Metylénová modrá však v tomto ohľade nie je chemicky jedinečná. Bázickými farbivami sú aj kryštálová violeť a safranín. Výber má optický, nie chemický dôvod.

Červené tyčinky potrebujú pozadie v kontrastnom odtieni a modrá predstavuje voči červenej najvhodnejší protiklad pre mikroskopiu v svetlom poli. Safranín by bol nevhodným kontrastným farbivom, pretože jeho výsledný ružovočervený odtieň je príliš blízky zadržanému karbolfuchsínu, čím by sa stratil práve ten rozdiel, ktorý postup vytvoril. Kryštálová violeť by vytvorila tmavofialové pozadie, ktoré by s tenkými červenými bacilmi súperilo o pozornosť. Najsilnejším dôkazom, že ide o kontrast, nie o chémiu, je možnosť náhrady: zelené kontrastné farbivá, napríklad malachitová zeleň a brilantná zeleň, sa používajú v niektorých veterinárnych a modifikovaných protokoloch a skúška stále funguje, pretože každý jasne odlišný odtieň plní rovnakú úlohu.

Z toho vyplývajú dva praktické dôsledky. Po prvé, štandardný recept nepredpisuje úpravu pH; nezamieňajte tento obyčajný vodný 0.3-percentný roztok s alkalickými formuláciami, ako je Loefflerova metylénová modrá, ktoré patria k inému princípu farbenia. Po druhé, prehnané farbenie škodí. Histologická literatúra výslovne upozorňuje, že príliš intenzívne modré pozadie môže prekryť ojedinelé bacily, takže ponechanie farbiva na sklíčku dlhšie, než povoľuje protokol, zhoršuje čitateľnosť bez akéhokoľvek prínosu.

Chémia bunkovej steny, ktorá umožňuje túto skúšku

Dôvod rozlišovacieho účinku kyslého alkoholu spočíva v mykobakteriálnom obale. Jeho štruktúrnym jadrom je komplex mykolyl-arabinogalaktán-peptidoglykán: peptidoglykán spojený s arabinogalaktánom, ktorého vonkajšie konce nesú mykolové kyseliny s veľmi dlhými reťazcami. Tie vytvárajú vonkajšiu mykomembránu bohatú na lipidy s nezvyčajne nízkou priepustnosťou. Prehľadový článok o vonkajšej membráne mykobaktérií podrobne opisuje túto architektúru. Bariéra pôsobí oboma smermi. Bráni vstupu farbiva, preto si prienik vyžaduje teplo alebo koncentrovanejšie primárne farbivo, a bráni jeho extrakcii, preto kyslý alkohol nedokáže odstrániť karbolfuchsín, keď už je vnútri. Bežné baktérie tento obal nemajú a farbivo strácajú. Acidorezistenciu je preto najlepšie chápať ako jav vyplývajúci z lipidovej bariéry, nie ako chemickú väzbu fuchsínu na mykolovú kyselinu.

Táto chémia vysvetľuje aj častú záhadu: mykobaktérie sa Gramovou metódou farbia slabo a nepredvídateľne, niekedy sa javia ako slabo zafarbené korálikovité útvary alebo nezafarbené obrysy buniek. Ich hydrofóbna stena obmedzuje prenikanie kryštálovej violeti. Farbenie na dôkaz acidorezistencie nie je modifikované Gramovo farbenie. Ide o iný diferenciačný princíp založený na inej vlastnosti bunkovej steny, ako pri zvyšných dvoch metódach ukazuje porovnanie jednoduchého farbenia a Gramovho farbenia.

Tri metódy, tri otázky

Širšiu skupinu bakteriálnych metód s jedným farbivom predstavuje atlas mikroskopického farbenia.

Čo červená na modrom pozadí nemôže dokázať

Červené tyčinky znamenajú, že organizmy si zachovali karbolfuchsín počas pôsobenia kyslého alkoholu. Takýto nález zodpovedá Mycobacterium tuberculosis, no odporúčania CDC pre diagnostiku tuberkulózy výslovne uvádzajú, že acidorezistentné sú aj iné mykobaktérie. Identifikácia druhu preto vyžaduje kultiváciu a testovanie nukleových kyselín, nie farbu.

Chyby v technike sa sústreďujú okolo dvoch premývacích krokov. Nedostatočné odfarbenie ponecháva materiál v pozadí červený a vedie k falošne pozitívnym hodnoteniam. Nadmerné odfarbenie odstraňuje slabo zadržané primárne farbivo a prispieva k falošne negatívnym výsledkom. Príliš intenzívne kontrastné dofarbenie prekryje ojedinelé bacily modrou. Hrubé nátery, vyzrážané reagencie a kontaminovaná oplachová voda pridávajú vlastné artefakty.

Citlivosť je obmedzená množstvom organizmov bez ohľadu na precíznosť techniky. Bežná mikroskopia náteru potrebuje približne 5,000 až 10,000 bacilov na mililiter spúta a staršie prehľady dôkazov CDC uvádzali citlivosť náteru približne 45 až 80 percent pri kultivačne potvrdených pľúcnych prípadoch. Negatívny náter preto nikdy nevylučuje tuberkulózu. Aktuálne odporúčania CDC zachovávajú kultiváciu popri každom nátere a odporúčajú test amplifikácie nukleových kyselín aspoň z jednej vzorky z dýchacích ciest, ak sa zvažuje pľúcna tuberkulóza a výsledok by zmenil ďalší postup.

Praktická práca sa musí riadiť schválenými protokolmi

Výučbové opisy vrátane tohto článku neoprávňujú na klinickú prácu. Pri laboratórnej práci sa riaďte validovaným štandardným pracovným postupom laboratória, ktorý je v súlade s aktuálnymi dokumentmi CDC, APHL alebo CLSI; referenčný dokument CDC o farbení na dôkaz acidorezistencie uložený v archíve Stacks ukazuje, ako takéto postupy špecifikujú reagencie a hodnotenie výsledkov. Práca so vzorkami na vyšetrenie tuberkulózy vyžaduje ochranné opatrenia: nátery sa pripravujú v boxe biologickej bezpečnosti, pretože pri príprave vznikajú aerosóly a rozstreky. Odporúčania CDC pre laboratórnu bezpečnosť uvádzajú, že aj tepelne fixované nátery môžu obsahovať životaschopné tuberkulózne bacily a stále sa s nimi musí zaobchádzať ako s kontaminovanými. Záznam v knižnici obrazov verejného zdravia CDC o nátere farbenom karbolfuchsínom a metylénovou modrou, vyšetrovanom na M. leprae, užitočne pripomína využitie metódy aj mimo tuberkulózy: rovnaký kontrast červenej na modrej slúži všade, kde sa hľadajú acidorezistentné organizmy, a aj dôkladne vyhodnotený negatívny nález je výsledkom, ktorý stojí za zaznamenanie.

Hodnotenie hotového sklíčka

Kontrastné farbivo sa uplatňuje pri úvodnom prehliadaní preparátu. Mikroskopista pri malom zväčšení najprv využíva modré pozadie na posúdenie kvality náteru: rovnomerné rozloženie buniek, neporušené bunky hostiteľa na zaostrenie a neprítomnosť výraznej zrazeniny. Červené podozrivé útvary potom priťahujú pozornosť práve preto, že nič iné na sklíčku nie je červené. Potvrdenie prebieha pri olejovej imerzii, kde skutočné bacily vykazujú očakávaný vzhľad tenkých, niekedy mierne zakrivených alebo korálikovitých tyčiniek, nie homogénnych zvyškov farbiva.

Zafarbenie pozadia určuje aj spôsob formulovania výsledku. Sklíčko s červenými bacilmi sa hodnotí ako nález acidorezistentných bacilov, často so semikvantitatívnym stupňom podľa stupnice laboratória. Sklíčko bez červených organizmov sa hodnotí ako nález bez pozorovaných acidorezistentných bacilov, nikdy nie ako negatívne na tuberkulózu. Tento rozdiel je dôležitý, pretože modré pole dokazuje, že farbenie fungovalo, bunky prijali kontrastné farbivo a optické podmienky boli primerané, no nehovorí nič o organizmoch pod hranicou detekcie. Modré pole bez nálezu je platným výsledkom o sklíčku, nie verdiktom o pacientovi.

Ak si zapamätáte rozdelenie úloh, správna formulácia výsledkov z neho vyplynie sama. Karbolfuchsín odhaľuje podozrivé bunky. Kyslý alkohol vykonáva skúšku. Metylénová modrá iba robí odpoveď čitateľnou: červené bunky si farbivo zachovali napriek pôsobeniu kyseliny, modré ho stratili. Všetko ostatné, druh, množstvo a klinický význam, vyplýva z vyšetrení nad rámec samotného sklíčka.