Metylénová modrá a autofágia: AMPK, mTOR a experimenty s neurónmi

Predstavte si, že robíte bunkový experiment, pridáte metylénovú modrú a na blote vidíte, ako proteínový pás označovaný LC3-II tmavne. Je lákavé vyhlásiť, že látka „podporuje autofágiu“, a ísť ďalej. Takýto výklad je predčasný. Tmavší pás LC3-II môže znamenať, že bunka vytvára viac vezikúl na odstraňovanie odpadu, alebo že sa vezikuly hromadia, pretože krok odstraňovania je zablokovaný. Tieto dve interpretácie smerujú k opačným záverom a literatúra o metylénovej modrej v neurónových modeloch obsahuje príklady oboch typov dôkazov. Tento článok postupne rozoberá, čo sa skutočne meralo, metódu po metóde.

Makroautofágia, forma skúmaná v tomto článku, je proces hromadnej recyklácie v bunke. Membránový vačok nazývaný fagofór rastie okolo opotrebovaných proteínov a organel, uzavrie sa do autofagozómu, splynie s lyzozómom a jeho obsah sa rozloží a uvoľní na opätovné využitie. Neuróny sú od tohto procesu závislé, pretože sa nedelia a nemôžu znižovať podiel poškodených súčastí delením. Keď sa recyklácia zastaví, odpad sa hromadí. Keď funguje, bunka v stresových podmienkach získava späť stavebné zložky.

Čo ukázal jeden experiment s hipokampálnymi bunkami

Kľúčová štúdia indukcie použila myšie hipokampálne bunky HT22 vystavené stresu odobratím séra na 24 hodín. Ide o podmienky, ktoré odstraňujú rastové faktory a trofické signály a spúšťajú apoptózu aj autofágiu. Výskumníci uviedli, že metylénová modrá znižovala odumieranie buniek v závislosti od dávky a že túto ochranu sprevádzali známky makroautofágie.

Zmeny markerov boli konkrétne. Difúzne farbenie LC3B sa približne od 20 nM metylénovej modrej prerozdeľovalo do bodových štruktúr v okolí jadra, pričom najsilnejšia odpoveď LC3-I a LC3-II sa objavila pri koncentrácii okolo 1 μM. Hladiny LC3B-I aj LC3B-II stúpali v závislosti od dávky a času. Podstatné je, že tím nezostal len pri statickom blote LC3. Pridali 10 μM chlorochínu, ktorý blokuje lyzozómové odbúravanie, a v bunkách ošetrených metylénovou modrou zistili vyššiu hladinu LC3-II spolu so stabilizovaným p62. Tento vzorec podporuje záver o obrate závislom od lyzozómov, nie o obyčajnom hromadení. Ukázali tiež, že chlorochín čiastočne zvrátil antiapoptotický účinok, čo v tomto modeli spája ochranu s autofagicko-lyzozómovou dráhou.

Výsledok týkajúci sa signalizácie sa najčastejšie cituje nesprávne. Signalizácia AMPK, hodnotená pomocou fosforylovanej AMPK a jej následného cieľa, fosforylovanej ACC, sa po 12 a 24 hodinách zvýšila v závislosti od dávky. Inhibítor AMPK Compound C, aplikovaný v koncentrácii 20 μM počas posledných 4 hodín, znížil fosforyláciu ACC aj aktiváciu LC3. Naproti tomu fosforylovaný mTOR nevykazoval žiadne zistiteľné potlačenie. V hipokampálnych bunkách vystavených stresu teda išlo o indukciu spojenú s AMPK prostredníctvom dráhy zjavne nezávislej od mTOR. Rovnaký vzorec sa objavil u živých myší, kde podávanie metylénovej modrej indukovalo markery makroautofágie v mozgovej kôre a hipokampe.

Indukcia neznamená dokončený autofagický tok

Práve tu je rozlíšenie pojmov najdôležitejšie. Indukcia znamená, že mechanizmy na začiatku dráhy vytvárajú viac autofagozómov. Tok znamená, že obsah prejde celou dráhou: zachytením, dozrievaním, splynutím s lyzozómom, rozkladom a recykláciou. Každé zvýšenie LC3-II zostáva tvrdením o indukcii, kým test toku nepotvrdí zvyšok tejto cesty.

Štandardný test toku meria LC3-II s krátkodobou blokádou lyzozómov, napríklad bafilomycínom A1 alebo chlorochínom, a bez nej. Ak zásah skutočne urýchľuje tvorbu, zablokovanie rozkladu by malo hladinu LC3-II ešte zvýšiť. Tandemový reportér mCherry-GFP-LC3 poskytuje druhý pohľad: pred splynutím s lyzozómom štruktúry svietia žlto a po tom, čo kyslé prostredie potlačí signál GFP, už iba červeno. Viac výlučne červených bodových štruktúr preto podporuje záver o postupe do kyslých autolyzozómov. Pokles hladiny proteínu p62 môže potvrdiť obrat obsahu, treba však pamätať na to, že samotná transkripcia p62 reaguje na stres a mala by sa kontrolovať na úrovni mRNA.

Nasledujúci kontrolný zoznam priraďuje každej metóde použitej v tejto literatúre to, čo meria, a to, čo sama osebe nedokáže preukázať. Čitatelia ho môžu použiť pri akomkoľvek budúcom tvrdení o makroautofágii vrátane argumentov o pôste a dlhovekosti, ktoré sa opierajú o tieto markery.

Všimnite si jednu terminologickú pascu, pred ktorou tabuľka chráni. Fosforylovaná ACC je enzymaticky inhibovaná forma. Jej nárast preukazuje výstupnú signalizáciu AMPK, nie aktiváciu ACC.

Rovnakú presnosť si zaslúži aj veta „inhibícia makroautofágie zrušila neuroprotekciu“. V modeli HT22 znamená, že zásah do autofagicko-lyzozómovej dráhy odstránil výhodu metylénovej modrej z hľadiska prežívania pri odobratí séra. Podporuje úlohu autofágie ako nevyhnutného alebo prispievajúceho procesu v danej kultúre. Nepreukazuje, že autofágia je jediným ochranným mechanizmom tejto látky, ani že chlorochín pôsobí výlučne prostredníctvom autofágie. Na posilnenie tvrdenia o príčinnej súvislosti by boli potrebné genetické zásahy do ATG5, ATG7 alebo ULK1.

Dve cesty k rovnakému mechanizmu

Pomôže zjednodušená mapa. Energetický stres zvyšuje aktivitu AMPK, AMPK aktivuje komplex ULK1 a autofágia sa spúšťa. Rastové faktory a živiny zvyšujú aktivitu mTORC1, mTORC1 inhibuje ULK1 a autofágia zostáva vypnutá. Za ULK1 v dráhe komplex Beclin-1 a VPS34 iniciuje tvorbu fagofóru, LC3-I sa lipidáciou mení na LC3-II, autofagozóm sa uzavrie, splynie s lyzozómom a obsah sa rozloží, pričom prebieha aj obrat p62.

Schéma umiestňuje každé zistenie o metylénovej modrej na túto mapu: výsledok z hipokampálnych buniek vedľa vetvy AMPK a výsledok z progenitorov vedľa vetvy mTOR.

Tento rámec vysvetľuje zdanlivý rozpor s druhou štúdiou Xieho a kolegov. V proliferujúcich potkaních neurálnych progenitorových bunkách samostatný experiment zistil, že 5 μM metylénovej modrej inhibovalo proliferáciu a podporovalo pokojový stav. Podiel buniek pozitívnych na Ki67 klesol v dňoch 1 a 3, zatiaľ čo diferenciácia buniek už nasmerovaných na neurónový vývoj zostala zachovaná. Mechanizmus tu prebiehal cez potlačenú signalizáciu mTOR: zníženie celkového mTOR a fosforylovaného mTOR spolu s nižšou expresiou p70S6K a 4EBP1, ako aj zníženie expresie cyklínov E1, B1, D1 a D2. Dominantným fenotypom bol pokojový stav progenitorov, ktorý autori spájali s oddialením senescencie, nie so záchranou hipokampálnych buniek vystavených stresu.

Medzi týmito dvoma prácami nie je rozpor. AMPK a mTOR sú integrátory citlivé na kontext, nie pevne nastavené prepínače. Bunka podobná neurónu vystavená stresu môže zapojiť AMPK bez merateľnej inhibície mTOR, zatiaľ čo progenitor stimulovaný mitogénmi môže na tú istú látku reagovať utlmením rastového mechanizmu závislého od mTOR. O tom, ktorá vetva prevládne, rozhodujú typ bunky, stresové podmienky, koncentrácia a čas merania. Aj preto do toho istého obrazu patria účinky metylénovej modrej na mitochondriálnu energetiku a redoxné procesy: ako opisuje prehľad mechanizmov neuroprotekcie, táto látka pôsobí ako alternatívny prenášač elektrónov, zapája antioxidačnú a antiapoptotickú signalizáciu, inhibuje MAO a NOS a súvisí s obnovou mitochondrií prostredníctvom biogenézy a autofágie. Autofágia je jednou vetvou pleiotropného profilu, nie celým vysvetlením.

Čo experimenty neukazujú

Odobratie séra modeluje trofický a metabolický stres v bunkovej kultúre. Nemodeluje pôst celého organizmu: glukóza, aminokyseliny a soli zostávajú v základnom médiu a neexistuje tu žiadne správanie súvisiace s príjmom potravy. Koncentrácie v kultúre od 20 nM do 5 μM nemožno aritmeticky prepočítať na dávky pre ľudí, pretože absorpcia, väzba na proteíny, redoxný stav, metabolizmus, hromadenie v tkanivách a čas expozície sa líšia.

Žiadna klinická štúdia u ľudí nebola navrhnutá tak, aby preukázala autofagický tok vyvolaný metylénovou modrou u pacientov. Mechanistické dôkazy stále pochádzajú z bunkových štúdií, prác ex vivo a pokusov na zvieratách a prehľady naďalej označujú dôkazy o prenose do klinickej praxe za predbežné. Tieto štúdie teda neukazujú, že metylénová modrá napodobňuje pôst, predlžuje ľudský život prostredníctvom autofágie alebo zabezpečuje dokončenie autofagického toku v ľudskom mozgu. Tvrdenia o napodobňovaní pôstu a dlhovekosti potrebujú vlastné klinické dôkazy a klinické štúdie metylénovej modrej pri iných indikáciách sa nestávajú štúdiami autofágie len na základe súvislosti. Výskum modelov nutričného stresu a dlhovekosti treba čítať s vedomím tejto hranice.

Pri ďalšej práci, ktorú budete čítať, použite kontrolný zoznam v uvedenom poradí. Najprv sa pýtajte, ktorá vetva sa zmenila: AMPK, mTOR alebo ani jedna. Potom sa pýtajte, či výsledok LC3 dopĺňal test toku, alebo zostal samostatný. Následne overte, či zablokovanie dráhy odstránilo prínos a akou metódou. Štúdia, ktorá odpovedá na všetky tri otázky, si zaslúži silné tvrdenie o mechanizme. Tá, ktorá odpovedá iba na prvú, ukázala signál umožňujúci spustenie procesu a zvyšok cesty zostáva nezmapovaný.