Metylénová modrá a podporné bunky mozgu: astrocyty, mikroglia a zápal

Predstavte si, že vykonáte dva experimenty s rovnakým modrým farbivom a získate dva povzbudivé výsledky. V jednej miske prežijú hviezdicovité podporné bunky nedostatok kyslíka a glukózy. V druhej si imunitné bunky mozgu zachovajú pokojový rozvetvený tvar napriek bakteriálnemu toxínu. Je lákavé spojiť oba výsledky do jediného tvrdenia: farbivo tlmí zápal v mozgu a chráni mozog. Práve pri tomto spájaní by sa však pozorní čitatelia mali pristaviť.

Mozog má dve populácie podporných buniek s odlišnými úlohami a metylénová modrá sa pri každej skúma s iným experimentálnym podnetom. Astrocyty sú bunky poskytujúce metabolickú podporu. Nachádzajú sa medzi krvnými cievami a neurónmi, odstraňujú nadbytočný glutamát, stabilizujú hladinu draslíka, ukladajú glykogén a pri prudkom náraste potreby dodávajú neurónom palivo. Mikroglia sú rezidentné imunitné hliadky. Ich jemné výbežky monitorujú tkanivo, zachytávajú bakteriálne signály a signály poškodenia a pri poplachu sa stiahnu do zaobleného améboidného tvaru prispôsobeného na migráciu a pohlcovanie, pričom uvoľňujú signálne molekuly. Výsledok v jednej populácii nemožno preniesť na druhú a použité meranie v každom prípade určuje, čo sa skutočne preukázalo.

Astrocyty pri metabolickom strese: rozhodujúcim výsledkom je načasovanie

Experiment s astrocytmi sa začína odňatím živín a kyslíka. Výskumníci kultivovali astrocyty z mozgovej kôry novonarodených myší, na šesť hodín odstránili glukózu a takmer všetok kyslík a potom oboje na dvadsaťštyri hodín obnovili. Ide o laboratórny model mozgovej príhody s následnou reperfúziou. Keď bola metylénová modrá prítomná počas fázy nedostatku, prežívanie buniek sa zhoršilo. Keď ju pridali až počas fázy reoxygenácie, pri koncentráciách 0.1 a 1 mikromólu na liter, prežívanie sa podľa kalceínového testu životaschopnosti významne zlepšilo. Štúdia na myších astrocytoch uvádza tento rozdiel v načasovaní spolu s údajmi o bunkovom dýchaní.

Práve tento rozdiel je najdôležitejším zistením. Počas fázy nedostatku nie je takmer žiadny kyslík, ktorý by prijímal elektróny, takže prenášač elektrónov ich nemá kam odovzdať. Počas reoxygenácie sa mechanizmus znovu rozbehne a farbivo má čo robiť. Astrocyty vystavené metylénovej modrej spotrebovali viac kyslíka, prijali viac glukózy, vytvorili viac ATP a obnovili zásoby glykogénu, pričom mali vyššiu aktivitu hexokinázy bez nárastu mitochondriálneho superoxidu. Navrhované vysvetlenie je známe z opisu metylénovej modrej ako mitochondriálneho prenášača elektrónov: prenáša elektróny mimo zablokovaných miest v dýchacom reťazci, takže sa bunkové dýchanie obnoví bez úniku elektrónov vedúceho k tvorbe reaktívnych foriem.

Všimnite si, o aký druh dôkazu ide. Je to výsledok týkajúci sa prežívania a metabolizmu jedného izolovaného typu buniek, s jasne určeným účinným časovým oknom (obnova, nie nedostatok) a rozsahom koncentrácií. Nehovorí nič o imunitnej signalizácii ani o správaní.

Mikroglia pri bakteriálnom poplachu: preprogramovaný metabolizmus

Experimenty s mikrogliami vychádzajú z opačného podnetu: nie z hladovania, ale z falošného signálu infekcie. Lipopolysacharid, fragment vonkajšej membrány baktérií, sa viaže na senzory vrodenej imunity a presvedčí mikroglia, že sa objavili patogény, hoci žiadne živé baktérie nie sú prítomné. U myší, ktorým podali lipopolysacharid, aj v kultivovanej mikrogliálnej bunkovej línii je výsledkom známy zápalový program: pribúdajú prozápalové faktory, mikroglia sa polarizujú smerom k agresívnemu stavu M1, susedné neuróny odumierajú a zvieratá dosahujú horšie výsledky v úlohách zameraných na učenie a pamäť.

Štúdia tejto reakcie na myšiach ju spája s dráhou snímania kyslíka: lipopolysacharid prostredníctvom nadradenej signálnej kaskády Siah2/Morg1 vyvoláva nadmernú expresiu PHD3, jedného z troch enzýmov prolylhydroxylázy. Bunky zároveň preprogramujú svoje využívanie energie smerom k aeróbnej glykolýze so zvýšenou hladinou mitochondriálnych reaktívnych foriem kyslíka. Autori tento posun priamo merali metabolickými testami Seahorse sledujúcimi spotrebu kyslíka a extracelulárnu acidifikáciu. Metylénová modrá zvrátila metabolický posun aj nadmernú expresiu PHD3, znížila hladiny zápalových faktorov, obmedzila odumieranie neurónov a zlepšila výsledky behaviorálnych testov. Pozitrónová emisná tomografia pridala zobrazovacie údaje: lipopolysacharid zvýšil vychytávanie glukózy v hipokampe pri FDG-PET a po podaní metylénovej modrej sa opäť znížilo, čo je v súlade s utlmenejším zápalovým metabolizmom v živom mozgu.

Ide o bohatší súbor meraní než v štúdii astrocytov (cytokíny, metabolizmus, zobrazovanie, správanie zvierat), no týka sa iného podnetu a inej bunky. Čitatelia porovnávajúci tieto dve štúdie by mali podnety rozlišovať: jedna štúdia zachraňuje hladujúce podporné bunky počas obnovy, druhá tlmí falošný infekčný poplach v imunitných bunkách.

Mikroglia pod mikroskopom: tvar ako meraný ukazovateľ

Tretí experiment skúma rovnaký bakteriálny poplach výlučne cez tvar buniek. V gliových kultúrach z mozgovej kôry potkanov majú kontrolné mikroglia zafarbené na marker IBA1 veľa jemných výbežkov, teda rozvetvený tvar typický pre monitorovanie okolia. Po dvadsiatich štyroch hodinách pôsobenia lipopolysacharidu v koncentrácii 10 mikrogramov na mililiter sa bunky splošťujú do améboidného tvaru a plocha ich bunkového tela sa zväčšuje, zatiaľ čo obvod zostáva približne rovnaký. To je geometrický znak zaobľovania. Metylénová modrá v koncentrácii 1 mikromólu na liter, podaná súčasne s toxínom, zachovala rozvetvené výbežky a udržala plochu aj obvod bunkového tela blízko kontrolných hodnôt. Štúdia na potkaních kultúrach kvantifikuje toto zachovanie tvaru meraním plochy a obvodu bunkového tela.

Dva detaily robia z tejto štúdie viac než len jednoduchý obrázok. Po prvé, porovnávacia látka menadión, ďalšia redoxne aktívna molekula v rovnakej koncentrácii, tvar nezachovala a sama posúvala bunky smerom k aktivovanej forme. Účinok teda nie je všeobecnou vlastnosťou všetkých látok schopných redoxného cyklovania. Po druhé, autori spájajú účinok farbiva s aktiváciou Nrf2, transkripčného faktora riadiaceho program antioxidačných a protizápalových génov, a nie iba s priamym vychytávaním reaktívnych foriem. Súvisiace texty o redoxnej a zápalovej signalizácii zasadzujú toto prepojenie s Nrf2 do širšieho kontextu.

Tvar je napriek tomu najmenej výpovedným z týchto troch ukazovateľov. Rozvetvená bunka zvyčajne monitoruje okolie a zaoblená bunka býva aktivovaná, ale morfológia je nepriamy ukazovateľ, nie transkript. Táto kultúra neobsahovala imunitné bunky pochádzajúce z krvi ani neurónové okruhy a neposkytovala žiadne údaje o správaní.

Porovnanie troch výsledkov

Spoločným vzorcom vo všetkých riadkoch je, že každý podnet má vlastné meranie a vlastnú odpoveď. Metabolická záchrana odpovedá na otázku o metabolizme. Údaje o cytokínoch a správaní odpovedajú na otázku o zápale. Tvar odpovedá na otázku o tvare. Ani jeden z týchto troch výsledkov sa sám osebe neprenáša do ostatných oblastí.

Čo pokojnejšie vyzerajúce mikroglia nedokazujú

Celá táto téma potrebuje jednu vetu: mikroglia, ktoré vyzerajú menej aktivované, alebo zmenený metabolizmus mikroglií samy osebe nedokazujú zlepšenie funkcie mozgu.

Morfológia sa môže zmeniť bez zodpovedajúcej zmeny funkcie. Bunka si môže zachovať výbežky a pritom stále uvoľňovať cytokíny, alebo sa môže zaobliť pri užitočnom odstraňovaní bunkových zvyškov. Metabolické merania majú rovnaké obmedzenie: záznam zo Seahorse alebo vyšetrenie PET ukazuje hospodárenie s energiou, nie kogníciu. Štúdia na myšiach, ktorá spojila metabolické a morfologické ukazovatele s behaviorálnymi testami, je silnejšia práve preto, že skombinovala viac úrovní dôkazov namiesto toho, aby sa celý záver opieral o jediné meranie. Aj tam platia obvyklé obmedzenia: lipopolysacharid modeluje sterilný poplach, nie skutočnú infekciu, myši nie sú ľudia a sami autori upozorňujú na medzidruhové rozdiely. Každý, kto plánuje nadväzujúci výskum, by mal zvážiť prenositeľnosť zistení o mikrogliách medzi modelmi skôr, než predpokladá, že sa daná dráha správa rovnako v ľudskom tkanive.

Z toho vyplýva praktický dôsledok pre načasovanie. V experimente s astrocytmi skoré podanie zhoršuje výsledok, kým podanie počas obnovy ho zlepšuje. Výsledky pri mikrogliách pochádzajú z podávania v čase okolo zápalového podnetu. Poškodenie mozgu v reálnom živote mieša obe fázy naraz: energetické zlyhanie aj imunitný poplach, ktoré sa vyvíjajú v priebehu hodín. Experiment izolujúci jednu fázu nemôže určiť časový plán pre ich kombináciu. Preto sa pri diskusiách o časových oknách podávania posudzuje priebeh nedostatku a priebeh zápalu oddelene.

Poctivé zhrnutie sa zmestí do jedného odseku. V izolovaných astrocytoch metylénová modrá podaná počas reoxygenácie obnovuje bunkové dýchanie a zachraňuje bunky. V mikrogliách vystavených bakteriálnemu fragmentu zvracia zápalový metabolický program prostredníctvom konkrétnej dráhy PHD3 a zachováva pokojový tvar. Každý výsledok je platný v rámci svojho experimentálneho usporiadania a ani jeden nie je všeobecným záverom o zápale v mozgu. Porovnanie gliových buniek je užitočné práve preto, že bráni tomu, aby tieto dva príbehy splynuli do jedného.