Metylénová modrá ako indikátor anaeróbnych podmienok a kyslíka: čo dokazuje zmena farby

Laborantka uzavrie anaeróbnu nádobu, cez veko skontroluje indikátorový prúžok s metylénovou modrou a uvidí to, čo chce vidieť. Prúžok sa zmenil z modrého na biely. Zaznamená, že proces prebieha anaeróbne, a pokračuje v práci. O dva dni neskôr na jednej platni nič nevyrastie, zatiaľ čo uzavretá skúmavka s bujónom v tej istej nádobe vykazuje známky vystavenia kyslíku. Prúžok hovoril pravdu. Položila mu nesprávnu otázku.

Problém spočíva v zámene pojmov. Anaeróbny indikátor s metylénovou modrou je založený na redoxných podmienkach, nie na sterilite ani na validácii celého systému. Keď je tento rozdiel jasný, prúžok sa stáva presným a spoľahlivým nástrojom s úzko vymedzenou úlohou.

Princíp: reverzibilný redoxný pár

Rozpustená metylénová modrá existuje v dvoch formách. Oxidovanou formou je známy modrý katión. Redukovaná forma, nazývaná leukometylénová modrá, je bezfarebná. Pri takmer neutrálnom pH vyzerá zjednodušená polreakcia takto: jeden modrý katión spolu s jedným protónom a dvoma elektrónmi vytvorí jednu bezfarebnú leukomolekulu. Formálny potenciál pri pH 7 je približne plus 11 milivoltov voči štandardnej vodíkovej elektróde. Patrí teda do rozsahu, ktorý dokážu dosiahnuť mnohé redukčné systémy a v ktorom kyslík dokáže reakciu obrátiť.

Redukcia vyžaduje nízky lokálny redoxný potenciál. Samotné odstránenie kyslíka na to nie vždy stačí. Prvé práce venované anaeróbnym podmienkam zistili, že metylénová modrá v čistej vode bez kyslíka si zachovala farbu, pokiaľ nebola prítomná redukujúca látka. Zmesi dextrózového bujónu s približne 0.01 percenta farbiva sa pri 37 C ľahko odfarbovali, zatiaľ čo tá istá zmes udržiavaná pri 4 C zostala modrá celý deň, ako sa uvádza v experimentoch s čerstvým tkanivom a anaeróbnymi kultivačnými podmienkami. Teplota, pH, glukóza, askorbát, tioglykolát aj redukčná aktivita mikroorganizmov ovplyvňujú dostupnosť elektrónov.

Na opätovnú oxidáciu stačí kyslík. Keď sa vzduch dostane k leukoforme, zmení sa späť na modrú. Moderné navrhnuté indikátory využívajú presne tento cyklus: farbivo, redukčné činidlo a stabilizačnú matricu. Pri nízkom obsahu kyslíka sú bezfarebné a po vystavení vzduchu opäť modré, ako ukazuje hybridný kyslíkový indikátor s metylénovou modrou založený na farbive, redukčnom činidle, povrchovo aktívnej látke a íle. Tento prototyp používal 0.01 milimolárne farbivo s 2.0 milimolárnym askorbátom alebo glukózou pri pH 11. Stával sa bezfarebným pri približne 0.5 objemového percenta kyslíka a vo svojej skúšobnej komore rozlišoval obsah kyslíka pod 0.1 percenta od obsahu nad 0.5 percenta.

Princíp fungovania je teda jednoduchý. Modrá znamená, že zóna indikátora je oxidovaná. Bezfarebný stav znamená, že zóna indikátora dosiahla redukčné podmienky s nízkym obsahom kyslíka. Zmena je reverzibilná, lokálna a chemická. Sama osebe nehovorí nič o mikroorganizmoch.

Ako funguje indikátorový prúžok s metylénovou modrou v anaeróbnej nádobe

Indikátorový prúžok s metylénovou modrou pre anaeróbnu nádobu predstavuje malú reakčnú zónu umiestnenú v atmosfére nádoby tak, aby ju bolo možné vidieť bez otvorenia nádoby. Komerčné formáty sa líšia: papierové prúžky, tablety rozpúšťané alebo zvlhčované pri príprave a novšie hybridné papiere. Niektoré vyžadujú na aktiváciu reakčnej zóny jednu kvapku destilovanej vody. Iné sú suché indikátory, ktoré musia zostať suché. Rozhodujúci je návod ku konkrétnemu výrobku, pretože hydratácia, umiestnenie a čas odčítania sú súčasťou chemického procesu.

V praxi má byť odčítanie binárne. Modrá znamená, že pri prúžku pretrváva kyslík alebo nedostatočne redukčné podmienky. Biela alebo bezfarebná forma znamená, že pri prúžku sa vytvorili anaeróbne redoxné podmienky. Niektoré komerčné papiere obsahujú aj červený podkladový pigment, takže ich konečný redukovaný stav je ružový, nie biely. Skôr než výsledok posúdite, zistite, aký koncový stav váš výrobok uvádza.

Čas závisí od systému. V jednej zostave typu GasPak sa odfarbovanie začalo približne do hodiny a dokončilo sa v priebehu niekoľkých hodín, zatiaľ čo pri kontrolovanom porovnaní pri izbovej teplote potrebovala metylénová modrá viac než šesť hodín. Redoxný potenciál médií v tejto práci dosiahol približne mínus 100 milivoltov v priebehu 60 až 100 minút, teda dlho pred dokončením zmeny farby. V čase, keď sa prúžok úplne odfarbil, bol už výrazne pod mínus 200 milivoltmi. Indikátor reaguje na zmenu atmosféry s oneskorením. Modrý prúžok po jednej hodine nedokazuje zlyhanie a biely prúžok po šiestich hodinách opisuje stav prúžku v šiestej hodine.

Z rovnakého dôvodu je dôležité umiestnenie. Prúžok ponechajte v plynovom priestore, viditeľný cez veko, mimo povrchov agaru a kultivačných médií. Signalizuje stav svojho bezprostredného okolia. Ak ho priložíte naplocho k studenej stene, zakryjete platňami alebo necháte nasiaknuť kondenzátom, bude signalizovať stav tohto mikroprostredia, nie nádoby.

Čo prúžok ukazuje a čo nie

Na indikátor s metylénovou modrou v anaeróbnej nádobe sa pozerajte ako na jeden senzor na jednom mieste. Určuje lokálne redoxné a kyslíkové podmienky vo vlastnej reakčnej zóne. Pri dostatočnom premiešaní a ustálení tieto podmienky vo všeobecnosti zodpovedajú plynovému priestoru. Všetko ostatné je odvodený záver a ten potrebuje samostatné dôkazy.

Bezfarebný prúžok nedokazuje sterilitu. Sterilita je neprítomnosť životaschopných organizmov, preukázaná validovanou sterilizáciou a kontrolami na validáciu kultivácie. Nádoba môže byť úplne anaeróbna a zároveň kontaminovaná alebo úplne sterilná a zároveň aeróbna.

Nevaliduje každú časť kultivačného systému. Rozpustený kyslík v uzavretej skúmavke, kyslík zachytený v hlbokých vrstvách agaru, gradienty v preplnenej nádobe a netesnosť, ktorá vznikne po odčítaní, unikajú dosahu jediného prúžku. Priestorové experimenty ukázali susediace modré a bezfarebné zóny v tej istej nádobe tam, kde sa prenikanie kyslíka a redukčná aktivita vyvažovali odlišne. Jeden bod nemôže potvrdiť stav celého objemu.

Nedokazuje nepretržité anaeróbne podmienky. Jednorazové odčítanie prúžku pri príprave nehovorí nič o dvadsiatej hodine. Novšie práce o kvalite anaeróbnych podmienok upozorňujú, že chemické indikátory opisujú atmosféru v okamihu odčítania a môžu vyzerať vyhovujúco aj pri nízkom zvyškovom obsahu kyslíka. Súvislosť medzi prúžkom a priebehom inkubácie vytvára priebežná dokumentácia alebo záznamy z kontrolných bodov, nie jediný pohľad na koncový stav.

Súvisiacu chémiu zmeny farby nájdete v článku ako metylénová modrá prechádza medzi oxidovanou a redukovanou formou. Širšie súvislosti vplyvu kyslíka na manipuláciu so vzorkami nájdete v téme kontroly kyslíka pri mikroskopii a kultivácii.

Schéma, ktorú sa oplatí mať pri nádobe

Nasledujúci obrázok zhŕňa článok do jednej pomôcky na pracovný stôl. Tri stavy toho istého prúžku, dva smery reakcie a hranica medzi údajom z indikátora a validáciou systému.

Príčiny zlyhania, ktoré udržia prúžok modrý alebo vyvolajú falošný pocit istoty

Väčšina zlyhaní patrí do piatich skupín. Každá má charakteristický prejav.

Netesná nádoba alebo vak neustále privádza kyslík do reakčnej zóny. Prúžok zostáva modrý alebo po odfarbení opäť zmodrie. Skôr než začnete hľadať chybu v chémii, skontrolujte veko, tesnenie, svorky a tesniace plochy.

Vyčerpaný alebo nesprávne aktivovaný generátor plynu kyslík vôbec neodstráni. Pri starších systémoch aktivovaných vodou boli skorými varovnými signálmi chýbajúca kondenzácia približne po 10 až 15 minútach a chýbajúce zahriatie veka približne po 20 až 40 minútach. Vrecko s nedostatočnou kapacitou v preťaženej nádobe zlyhá rovnakým spôsobom.

Otrávený katalyzátor sa týka iba starších systémov využívajúcich vodík a paládium, v ktorých paládium sprostredkúva spojenie vodíka a kyslíka na vodu. Vlhkosť a sírovodík ho znehodnocujú. Mnohé súčasné vrecká paládium vôbec nepoužívajú, preto tento spôsob nápravy neuplatňujte tam, kam nepatrí.

Znehodnotený prúžok alebo prúžok, s ktorým sa nesprávne zaobchádzalo, zlyháva nenápadne. Farbivo a redukčné činidlo počas skladovania strácajú reverzibilitu, čo je jeden z dôvodov vývoja hybridných formulácií odolných voči vyblednutiu pôsobením svetla a strate funkčnosti pri skladovaní. Vyraďte zásoby po exspirácii, zásoby s neobvyklou počiatočnou farbou a prúžky zvlhčené napriek požiadavke na suchý stav alebo ponechané suché napriek požiadavke na zvlhčenie.

Gradient alebo oneskorenie zavádza používateľa, nie samotnú chemickú reakciu. Nedostatočne premiešaný plynový priestor, uzavreté skúmavky s rozpusteným kyslíkom a polotuhé médiá si zachovávajú vlastné podmienky dlhšie, než naznačuje prúžok. Prúžky s rezazurínom prechádzajú cez ružovú farbu do bezfarebného stavu a často sa predávajú ako rýchlejšie. Ich prahové hodnoty však závisia od vlastnej formulácie a nemožno ich prenášať na metylénovú modrú.

Kontroly a postup odčítania, ktoré sa oplatí prevziať

Dve lacné kontroly zachytia väčšinu chybných odčítaní. Počas procesu ponechajte vedľa nádoby čerstvý kontrolný prúžok na vzduchu v miestnosti. Funkčný prúžok s metylénovou modrou tam zostáva modrý. Niektoré balené indikátory sú spočiatku bledé a po otvorení zmodrajú, čo samo osebe predstavuje kontrolu funkčnosti. Pravidelne tiež vložte čerstvý prúžok do už validovanej anaeróbnej zostavy. Mal by dosiahnuť validovaný redukovaný koncový stav v čase stanovenom pre výrobok. Ak sa niektorá kontrola správa nesprávne, vymeňte šaržu skôr, než budete dôverovať údajom z nádoby.

Postup odčítania vyplýva z mechanizmu. Umiestnite prúžok do viditeľnej časti plynového priestoru tak, aby ho bolo možné odčítať bez otvorenia nádoby, a dodržte pokyny výrobku týkajúce sa kontaktu so stenou a zvlhčovania. Zaznamenajte počiatočnú farbu, čas uzavretia nádoby a farbu v kontrolnom bode stanovenom pre výrobok. Ak to nádoba umožňuje, v určených kontrolných bodoch počas inkubácie zaznamenajte, že indikátor zostal redukovaný. Konečnú farbu zaznamenajte bezprostredne pred otvorením. Táto farba pred otvorením je koncovým stavom daného procesu. Po otvorení očakávajte opätovné zmodranie a nedovoľte, aby zmenilo predchádzajúce hodnotenie.

Ak prúžok zostane modrý aj po stanovenom čase, považujte anaeróbne podmienky za neoverené. Postupne skontrolujte celý reťazec: tesnosť, vrecko, prípadný katalyzátor, hydratáciu a exspiráciu indikátora a potom jeho funkčnosť v porovnaní s kontrolou na vzduchu. Rast alebo neprítomnosť rastu interpretujte až po overení atmosféry, s použitím anaeróbnej kultivačnej zostavy a kontrol s organizmami vhodných pre dané použitie.

Prúžok si zaslúži posledné slovo vo svojej vlastnej oblasti. Či je modrý alebo bezfarebný, odpovedá na jednu otázku o jednom mieste v jednom čase. Položte mu túto otázku v stanovenom čase, s kontrolami vedľa neho, a odpovie spoľahlivo. Ak sa ho na základe jediného pohľadu pýtate na sterilitu, každú skúmavku alebo celú inkubáciu, správnosť interpretácie nezachráni žiadna indikátorová chémia.