Metylénová modrá a neurotransmitery: serotonín, dopamín, GABA a acetylcholín

O metylénovej modrej sa často hovorí, že zvyšuje serotonín, zvyšuje dopamín, upokojuje GABA a zostruje pôsobenie acetylcholínu, a to všetko naraz. Takáto veta spája štyri samostatné laboratórne zistenia do jedného účinku v ľudskom tele. Štúdie, z ktorých vychádza, merali rôzne ciele v rôznych preparátoch pri koncentráciách, ktoré sa líšia približne tisícnásobne. Keď tieto ciele oddelíme, obraz je zaujímavejší, ale zároveň si vyžaduje väčšiu opatrnosť, než umožňuje jediná veta.

Základná myšlienka je jednoduchá. Molekula, ktorá sa naviaže na enzým v skúmavke, urobila jednu vec: naviazala sa na enzým v skúmavke. To, či sa tým zmení hladina neurotransmitera v živom mozgu, závisí od koncentrácie, ktorá sa dostane do tkaniva, od chemickej formy molekuly pri jej príchode a od všetkého ostatného, čo molekula pri rovnakej koncentrácii robí. Každá nasledujúca časť ponecháva tieto tri otázky pri zistení, ku ktorému patria.

Serotonín: dva ciele, dve koncentrácie

Zo štyroch systémov má serotonín najsilnejšie dôkazy. Pochádzajú z dvoch odlišných molekulových cieľov, ktoré by sa nemali spájať.

Prvým cieľom je monoaminooxidáza typu A, mitochondriálny enzým, ktorý rozkladá serotonín. Metylénová modrá inhibuje purifikovanú ľudskú MAO-A ako pevne sa viažuci inhibítor s Ki približne 27 nanomolárnou, zatiaľ čo na ovplyvnenie MAO-B sú potrebné oveľa vyššie koncentrácie, ako ukázala kinetická štúdia, ktorá spojila farbivo so serotonínovou toxicitou. Súvisiaci výskum zistil rovnakú selektivitu v tkanive epifýzy potkanov, kde blokáda MAO-A zvýšila množstvo indolov odvodených od serotonínu, znížila množstvo serotonínového metabolitu 5-HIAA a zmenila vzpriamovací reflex u žiab spojený so serotonínom, ako uvádza štúdia redoxných farbív a indolov epifýzy. Dva rôzne preparáty, rovnaký smer: menej rozkladu, viac zachovaného serotonínu tam, kde by ho enzým odstránil.

Druhým cieľom je samotný serotonínový transportér. V bunkách exprimujúcich ľudský transportér metylénová modrá znížila vychytávanie fluorescenčného substrátu aj značeného serotonínu s IC50 približne 1.4 mikromolárnou a potlačila prúdy vyvolané serotonínom pri meraniach metódou patch-clamp, podľa priamej charakterizácie pôsobenia metylénovej modrej na SERT. Autori preverili zjavné alternatívne vysvetlenia a zistili, že účinok nezávisel od signalizácie cGMP, zmien vápnika ani expresie transportéra na povrchu buniek.

Všimnite si rozdiel medzi týmito dvoma číslami. Inhibícia MAO-A prebieha pri nanomolárnych koncentráciách. Inhibícia transportéra si vyžaduje približne päťdesiatkrát viac farbiva. Nízka expozícia, ktorá plne ovplyvní enzým, môže transportér zasiahnuť len minimálne. Každý, kto tieto zistenia spája do jediného tvrdenia o serotoníne, zlieva dva rôzne koncentračné rozsahy do jedného.

To, či má niektorý z týchto cieľov význam u človeka užívajúceho ďalšie serotonergné lieky, je otázka týkajúca sa liekov a patrí do sprievodcu liekovými interakciami. Tento článok mapuje ciele; klinické odporúčania obsahuje uvedená stránka.

Dopamín: najslabšie priame dôkazy

Pri dopamíne si poctivý prístup vyžaduje najväčšiu zdržanlivosť. Neexistuje dobre podložená štúdia, ktorá by ukazovala, že metylénová modrá blokuje dopamínový transportér alebo sa priamo viaže na dopamínové receptory. Často citovaná hodnota IC50 transportéra 1.4 mikromolárna patrí serotonínovému transportéru, nie DAT, a nikdy by sa nemala pripisovať inému cieľu.

Existujúce dôkazy sú namiesto toho nepriame. Keďže enzýmy MAO metabolizujú aj dopamín, inhibícia MAO zachováva dopamín spolu so serotonínom a noradrenalínom. V mitochondriálnych preparátoch metylénová modrá blokovala premenu neurotoxínu MPTP sprostredkovanú MAO-B na látku toxickú pre dopaminergný systém s potenciou porovnateľnou s deprenylom, liekom na Parkinsonovu chorobu, ako opisuje štúdia bioaktivácie MPTP a súvisiaci výskum MAO-B. Výskum na zvieratách pridáva čiastkové zistenia: približne trojnásobné zvýšenie bazálneho uvoľňovania dopamínu z rezov striata potkanov pri 10 mikromolárnej koncentrácii, skúmané v kontexte signalizácie oxidu dusnatého, nie blokády transportéra, a rozdielne výsledky medzi oblasťami po systémovom podaní, pričom niektoré štúdie zistili zvýšenie serotonínu a noradrenalínu, zatiaľ čo dopamín sa takmer nezmenil.

Dopamínový príbeh je teda skutočný, ale nepriamy. Vedie cez enzým, ktorý spracúva viacero monoamínov naraz, nie cez cieľ špecifický pre dopamín. Každé tvrdenie, že metylénová modrá zvyšuje dopamín u ľudí, preskakuje krok, v ktorom by sa to skutočne preukázalo.

GABA: blokovanie brzdy vo väzbovom mieste

Zistenie týkajúce sa GABA je presné a ide proti všeobecnej predstave o farbive. V bunkách exprimujúcich ľudské receptory GABA-A metylénová modrá inhibovala prúdy vyvolané GABA už približne od 3 mikromolárnej koncentrácie, s IC50 približne 31 mikromolárnou pre bežnú konfiguráciu alfa1-beta2-gama2, podľa elektrofyziologickej štúdie, ktorá zmapovala miesto pôsobenia.

Cennou časťou je zmapovanie miesta pôsobenia. Mutácie v pikrotoxínovom mieste nezmenili inhibíciu a benzodiazepínové aj zinkové miesta boli vylúčené porovnaním podjednotiek. Naopak, mutácie dvoch aminokyselinových zvyškov, o ktorých je známe, že tvoria samotné väzbové miesto GABA, výrazne oslabili blokádu. To označuje pôsobenie za kompetitívny antagonizmus na mieste agonistu, nie za alosterickú moduláciu inde. Účinok pretrvával pri synaptických aj extrasynaptických kombináciách podjednotiek a po vymytí rýchlo ustúpil.

Vzniká tým skutočný rozpor, ktorý stojí za to jasne pomenovať. Molekula skúmaná na podporu pamäti zároveň potláča rýchly inhibičný prenos v laboratórnej miske. To, či k tomuto potlačeniu dochádza aj v živom mozgu, závisí od miestnej koncentrácie, pričom 31 mikromolárna koncentrácia je v porovnaní s väčšinou systémových expozícií vysoká, čomu sa venuje záverečná časť. Samotný rozpor je týmto zistením; jeho vyriešenie by si vyžadovalo experimenty, ktoré zatiaľ nikto nevykonal.

Acetylcholín: dva protichodné body pôsobenia

Pri acetylcholíne existujú dve zistenia, ktoré pôsobia opačnými smermi, a práve preto sa musia uvádzať oddelene.

Na jednej strane metylénová modrá inhibuje enzýmy, ktoré odstraňujú acetylcholín. Acetylcholínesteráza z kravských červených krviniek bola kompetitívne inhibovaná približne pri 0.57 mikromolárnej koncentrácii, hovädzí enzým približne pri 0.42 mikromolárnej koncentrácii a esterázová aktivita ľudskej plazmy približne pri 1.1 mikromolárnej koncentrácii. Butyrylcholínesteráza bola inhibovaná v rozsahu približne 0.4 až 5.3 mikromolárnej koncentrácie podľa druhu a preparátu, ako sumarizuje prehľad pôsobenia metylénovej modrej v nervovom systéme. Spomalenie odstraňovania ponecháva v synapse viac neurotransmitera, čo je rovnaký princíp, na ktorom stojí niekoľko schválených liekov na Alzheimerovu chorobu.

Chemická stránka však má jednu podmienku. Oxidovaná modrá forma enzým inhibuje; redukovaná bezfarebná forma nie. Dlhé inkubácie, počas ktorých sa farbivo môže redukovať, preto vykazujú slabšiu inhibíciu už len z tohto dôvodu. Každá hodnota z merania cholínesterázy má skrytú premennú: aká časť farbiva bola pri meraní ešte modrá.

Na druhej strane metylénová modrá blokuje nikotínový receptor alfa7, jeden z receptorov, na ktoré acetylcholín pôsobí. Ľudské receptory alfa7 exprimované v oocytoch žiab boli inhibované s IC50 približne 3.4 mikromolárnou prostredníctvom nekompetitívneho antagonizmu nezávislého od napätia, ktorý nemenil potenciu agonistu. Koncentrácia 3 mikromolárna zároveň úplne potlačila synaptické odpovede vyvolané cholínom v rezoch hipokampu potkanov, ako uvádza štúdia receptora alfa7. Pri podobných nízkych mikromolárnych koncentráciách teda farbivo zároveň zachováva neurotransmiter a tlmí jeden z jeho receptorov. Celkový účinok na cholinergnú signalizáciu sa nedá odvodiť zo žiadneho z týchto zistení samostatne. Táto nejednoznačnosť súvisí so širšou literatúrou o Alzheimerovej chorobe aj so súvisiacou diskusiou o výskume kognície a chorôb, no tu zostáva nevyriešená.

Porovnanie na jednom mieste

Najcitlivejší cieľ od najmenej citlivého oddeľujú tri rády. Tento rozsah zhŕňa celý článok v jednej tabuľke.

Dostávajú sa tieto koncentrácie do mozgu?

Hodnota zo skúmavky nič neznamená bez údaja o expozícii vedľa nej. Po intravenóznom boluse približne 1.4 mg na kg boli hlásené priemerné hladiny v ľudskej plazme okolo 5 mikromolárnej koncentrácie, zatiaľ čo perorálna dávka 100 mg v tom istom okruhu literatúry dosiahla v plnej krvi hladinu približne 0.08 mikromolárnej koncentrácie. Výskum distribúcie u potkanov zistil hladiny v mozgu približne desať- až dvadsaťnásobne vyššie než v obehu. Ide však o celkové množstvo farbiva v homogenizovanom tkanive, nie o voľné oxidované farbivo pri synapse. Väzba na plazmatické bielkoviny približne na úrovni 94 percent spolu s distribúciou do krviniek navyše znižuje voľnú frakciu.

Pri porovnaní s tabuľkou je obraz odstupňovaný, nie binárny. Inhibícia MAO-A nastáva pri koncentráciách výrazne nižších než pri typických intravenóznych expozíciách a pri takomto podaní farbiva je farmakologicky vierohodná. Účinky na cholínesterázu a alfa7 sa nachádzajú v nízkom mikromolárnom pásme, s ktorým sa maximálne koncentrácie po intravenóznom podaní prekrývajú, ale bežné perorálne dávky ho nemusia dosiahnuť. IC50 pre GABA-A na úrovni 31 mikromolárnej koncentrácie je nad väčšinou reálne predpokladaných systémových expozícií, takže túto konkrétnu blokádu je najťažšie predpokladať v celom ľudskom organizme. Každý riadok tohto porovnania potrebuje rovnakú výhradu: relevantná je koncentrácia voľného, oxidovaného, extracelulárneho farbiva pri cieli, teda veličina, ktorú žiadny odber krvi nemeria priamo.

Čo z toho nemožno vyvodiť

Žiadny riadok tabuľky nedokazuje, že metylénová modrá u človeka predvídateľne zvyšuje alebo znižuje hladinu ktoréhokoľvek neurotransmitera. Inhibícia enzýmu v purifikovanom preparáte, blokáda transportéra v bunkovej línii aj antagonizmus receptora v tkanivovom reze sú vždy o jeden kontrolovaný krok vzdialené od synaptickej reality. Časť o cholinergnom systéme navyše ukazuje, ako sa dve pravdivé zistenia navzájom vyvažujú a výsledkom je neistota. Zodpovedné využitie tejto stránky spočíva v tom, že ju chápeme ako mapu cieľov, na ktoré molekula preukázateľne pôsobí, s vyznačenou silou tohto pôsobenia, aby diskusia o mechanizmoch zostala ukotvená v tom, čo sa skutočne meralo. O tom, ako tieto body pôsobenia interagujú s predpísanými liekmi, pojednáva sprievodca interakciami, ktorý túto úlohu plní spolu s ďalším kontextom v základoch farmakológie a v sprievodnom vysvetlení mechanizmov.