Metylénová modrá a expozícia svetlu: vlnová dĺžka, irradiancia a geometria ožarovania

Dve práce uvádzajú ožiarenie metylénovej modrej dávkou svetla 10 J na štvorcový cm. V jednej dochádza k usmrteniu baktérií. V druhej sa nedeje nič merateľné. Čitateľ, ktorý porovnáva len dávku, dospeje k záveru, že výsledky v tejto oblasti sú nekonzistentné. Oblasť je však konzistentná. Samotná dávka nikdy nevystihovala celú expozíciu.

Expozícia svetlu je malý systém parametrov, ktoré pôsobia spoločne: vlnová dĺžka, irradiancia, trvanie, výsledná fluencia, dostupnosť kyslíka, koncentrácia farbiva a stav jeho agregácie, časový odstup medzi podaním farbiva a ožiarením a optická dráha, ktorú svetlo skutočne prejde vzorkou. Zmena jedného z nich mení fotochémiu. Tento článok postupne rozoberá každý parameter a následne odlišuje fotobiomoduláciu blízkym infračerveným svetlom od priamej fotoaktivácie farbiva, pretože práve tieto dva režimy sa najčastejšie zamieňajú.

Vlnová dĺžka rozhoduje o tom, či sa farbivo zapojí

Metylénová modrá vo vode silno absorbuje červené svetlo vo forme monoméru, s maximom približne pri 664 až 665 nm a ramenom absorpčného pásu pri kratšej vlnovej dĺžke okolo 610 nm, ktoré rastie pri agregácii farbiva do dimérov a väčších zoskupení. Molárny absorpčný koeficient v blízkosti maxima je rádovo 65,000 až 85,000 M-1 cm-1, takže už mikromolárne roztoky sú intenzívne modré. Starší prehľad fotochémie metylénovej modrej s DNA a biologickými substrátmi dokumentuje toto absorpčné správanie aj následnú chémiu excitovaného stavu: absorpcia vedie ku krátko žijúcemu singletovému stavu a následnému prechodu do dlhšie žijúceho tripletového stavu s uvádzanými výťažkami okolo 0.5, ktorý sa v prevzdušnenom roztoku deaktivuje kyslíkom približne do 2 mikrosekúnd.

Práve pri tomto kroku deaktivácie sa obe fotochemické dráhy rozchádzajú. Pri chémii typu II prenáša farbivo v tripletovom stave energiu na kyslík v základnom stave a vytvára singletový kyslík, s bežne uvádzanými výťažkami okolo 0.52. Pri chémii typu I namiesto toho prenáša elektrón alebo vodík na substrát, čím vznikajú radikály vrátane superoxidu a hydroxylových radikálov. Obe dráhy môžu prebiehať súčasne a konvenčný fotodynamický účinok zostáva silno závislý od kyslíka aj vtedy, keď k nemu prispieva typ I.

Z toho vyplýva jednoduché pravidlo pre výber vlnovej dĺžky pre metylénovú modrú. Červené svetlo približne od 630 do 680 nm sa prekrýva s absorpčným pásom farbiva, pričom 660 až 665 nm leží blízko maxima monoméru. Môže teda vyvolávať fotosenzibilizačnú chémiu všade, kde je prítomné nezanedbateľné množstvo farbiva. Blízke infračervené svetlo pri 810 nm leží výrazne mimo absorpčného pásu základného stavu, preto je na priamu excitáciu farbiva nevhodné. Koncentrácia situáciu komplikuje jedným podstatným spôsobom: s jej rastom je viac farbiva v dimérnych a agregovaných formách, ktoré absorbujú bližšie k 610 nm a na jednu molekulu fotosenzibilizujú menej účinne. Zdvojnásobenie množstva farbiva preto nezdvojnásobí účinok. Súvisiaci prehľad metylénovej modrej a terapie červeným svetlom považuje toto absorpčné pravidlo za predpoklad akejkoľvek fotosenzibilizovanej reakcie.

Irradiancia, trvanie a fluencia sú tri parametre, nie jeden

Fluencia v J na štvorcový cm je irradiancia vynásobená časom. Uvádzanie samotnej fluencie skrýva rýchlosť, akou energia prichádzala, a na tejto rýchlosti záleží.

Vysoká irradiancia pôsobiaca krátko a nízka irradiancia pôsobiaca dlho môžu viesť k rovnakej fluencii, ale odlišnej chémii. Vysoká irradiancia spotrebúva rozpustený kyslík rýchlejšie, než ho difúzia dopĺňa, čím počas expozície obmedzuje dráhu typu II závislú od kyslíka. Zároveň dodáva teplo a tkanivo reaguje na zahrievanie zmenami prietoku krvi, ktoré menia okysličenie aj rozloženie farbiva. Nízka irradiancia počas dlhej expozície umožňuje priebežné dopĺňanie kyslíka, no zároveň poskytuje čas na opravné procesy a opätovné okysličenie už počas samotnej expozície. Učebnice fotochémie označujú predpoklad, že záleží len na celkovej dávke, ako reciprocitu. Tá neplatí vždy, keď sa zapája kyslík, zahrievanie alebo biologické procesy, čo v tkanive znamená takmer vždy.

Pri antimikrobiálnych fotodynamických expozíciách s metylénovou modrou u ľudí sa bežne používa 6 až 18 J na štvorcový cm, čo sa prekrýva s hodnotami pri fotobiomodulácii. Samotná fluencia preto nedokáže určiť režim. Expozícia 10 J na štvorcový cm pri 660 nm v tkanive obsahujúcom farbivo predstavuje fotochémiu sprostredkovanú fotosenzibilizátorom. Rovnaká fluencia pri 810 nm v tkanive so stopovým množstvom farbiva je niečo úplne iné. Číslo je rovnaké. Koncept sa líši.

Optická dráha a geometria vzorky rozhodujú o tom, s čím sa svetlo stretne

Podľa Beerovho-Lambertovho zákona dostáva predná časť vzorky oveľa viac svetla než zadná. V kyvete s koncentráciou farbiva v desiatkach mikromólov na liter môže prvý milimeter absorbovať väčšinu dopadajúceho červeného svetla, takže hlbšie vrstvy zostávajú prakticky neožiarené. Ak ten istý roztok umiestnite v malom objeme do plytkej jamky, expozícia bude takmer rovnomerná. Rovnaké farbivo, rovnaká lampa, rovnaká fluencia na povrchu, odlišný výsledok.

V tkanive sa k absorpcii pridáva rozptyl. Červené svetlo okolo 660 nm preniká rádovo do hĺbky milimetrov, pričom presnú hĺbku určuje obsah krvi, pigmentácia a typ tkaniva. Jamky pridávajú vlastné artefakty: šošovkový efekt menisku, odrazy od stien, zatienenie okrajových jamiek a zahrievanie malých objemov pod zdrojom. Dve laboratóriá, ktoré uvádzajú rovnaké nastavenia lampy, ale odlišné typy platničiek, objemy alebo vzdialenosti zdroja, vykonali odlišné experimenty.

Vzdialenosť si zaslúži osobitnú pozornosť, pretože je najčastejšou neuvádzanou premennou. Irradiancia rýchlo klesá so vzdialenosťou od nekolimovaného zdroja, takže posunutie lampy z 2 cm na 5 cm nad platničkou môže irradianciu znížiť niekoľkonásobne, hoci opis v časti o metódach zostane rovnaký. Bez merania irradiancie na povrchu vzorky sú publikované fluencie vypočítané z výkonových údajov výrobcu iba odhadmi, nie meraniami.

Sprievodca parametrami s vysvetlivkami: čo robí expozíciu reprodukovateľnou

Pôvodným materiálom pre túto stránku je kontrolný zoznam. Expozíciu svetlu v štúdii, ktorá tieto položky neuvádza, nemožno porovnať s inou, nech sa hlavná uvádzaná dávka javí akokoľvek podobná.

1. Vlnová dĺžka a šírka pásma. Maximum a plná šírka, nie názov farby. Červené LED pokrývajú rozsah 630 až 680 nm, v ktorom sa absorpcia farbiva výrazne líši.
2. Irradiancia na povrchu vzorky, meraná, v mW na štvorcový cm. Výkon vo wattoch uvádzaný výrobcom nie je irradiancia.
3. Trvanie a pulzný režim. Kontinuálne verzus pulzné ožarovanie vrátane frekvencie pulzov a striedy, ak sú relevantné.
4. Fluencia vypočítaná z vyššie uvedenej meranej dvojice hodnôt, v J na štvorcový cm.
5. Koncentrácia farbiva, formulácia a stav agregácie. Monomér pri približne 664 nm fotosenzibilizuje inak než agregáty pri približne 610 nm.
6. Interval medzi podaním látky a ožiarením. Minúty až hodiny medzi podaním farbiva a ožiarením určujú, kde sa farbivo nachádza v čase príchodu svetla.
7. Okysličenie. Prevzdušnený roztok oproti hypoxickému tkanivu priamo mení rovnováhu medzi typom I a typom II.
8. Geometria. Hĺbka vzorky, objem, typ nádoby, vzdialenosť a uhol zdroja a hĺbka cieľového miesta v tkanive.

Užitočný návyk pri čítaní prác: najprv skontrolujte interval medzi podaním látky a ožiarením. Prezrádza zámer. Fotodynamické experimenty zámerne ožarujú tkanivo obsahujúce farbivo. Kombinované experimenty môžu oba zásahy zámerne časovo oddeliť, ako je uvedené nižšie.

Fotobiomodulácia blízkym infračerveným svetlom nie je fotoaktivácia farbiva

Fotobiomodulácia, zvyčajne označovaná skratkou PBM, používa červené alebo blízke infračervené svetlo na moduláciu endogénnej signalizácie bez pridania fotosenzibilizátora. Fotodynamická terapia, zvyčajne označovaná skratkou PDT, spoločne využíva tri zložky: svetlo absorbované senzibilizátorom, samotný senzibilizátor a kyslík na vytvorenie náhleho množstva reaktívnych častíc, ktoré poškodzujú cieľ. Prehľad mitochondrií ako cieľa neuroprotekcie spája metylénovú modrú s PBM, pretože na bunkové dýchanie pôsobia z rôznych strán: farbivo funguje ako katalytický redoxný prenášač podporujúci tok elektrónov, zatiaľ čo pri PBM sa predpokladá, že podporuje disociáciu inhibičného oxidu dusnatého z cytochróm c oxidázy v komplexe IV. Tento enzýmový mechanizmus musí zostať označený ako hypotéza.

Dve najčastejšie citované kombinované štúdie na myšiach používajú svetlo pri 810 nm, a práve preto nepreukazujú fotoaktiváciu farbiva. V štúdii predbežného podávania pred spánkovou depriváciou dostávali myši pred depriváciou denne metylénovú modrú v dávke 0.5 mg na kg, pulzný laser pri 810 nm každý druhý deň alebo oboje. Kombinovaný predbežný zásah chránil prejavy pamäťového správania a hipokampálne synaptické proteíny, zatiaľ čo samostatné zásahy zväčša zlyhali. V štúdii chronického stresu so súbežnými zásahmi dostávali myši PBM pri 810 nm s fluenciou 8 J na štvorcový cm spolu s denným podávaním farbiva v dávke 0.5 mg na kg. Najprv sa aplikoval laser a farbivo sa injekčne podalo o dve hodiny neskôr, výslovne s cieľom vyhnúť sa ožiareniu tkaniva obsahujúceho farbivo. Všetky tri skupiny vykázali zvrátenie deficitov učenia, pričom aditívny prínos sa týkal najmä sérového kortizolu a reaktívnych foriem kyslíka v mozgu. Tieto výsledky skúmajú dva mitochondriálne zásahy použité spoločne. Súbor fotodynamických štúdií toto rozlíšenie zachováva tým, že pri každej indikácii zaznamenáva vlnovú dĺžku.

Dôkazy týkajúce sa kože patria na druhú stranu tohto rozlíšenia. Údaje o metylénovej modrej v kombinácii so svetlom na ľudskej koži sa sústreďujú na rozsah 630 až 680 nm s lokálne alebo intralezionálne podaným farbivom a so zámerom deštrukcie alebo remodelácie, čo je podľa definície PDT. Uvádzať takto dosiahnuté odstránenie lézií ako dôkaz, že farbivo zosilňuje PBM, alebo uvádzať nápravu pri 810 nm u myší ako dôkaz, že panel pri 660 nm spolu s farbivom predstavuje protokol pre kognitívne funkcie, znamená zamieňať tieto režimy. Referenčný materiál o dávkovaní a farmakológii a sprievodca bezpečnosťou a interakciami ďalej rozvíjajú časti tejto témy týkajúce sa koncentrácie a kontraindikácií.

Pred porovnávaním čísel pomenujte koncept. Vlnová dĺžka určuje, či farbivo absorbuje svetlo. Irradiancia a trvanie určujú, čo chémia s touto absorpciou urobí. Geometria určuje, ktorá časť vzorky je tým vôbec zasiahnutá. Dve expozície, ktoré sa zhodujú v jednom parametri a líšia sa vo všetkých ostatných, sú odlišné experimenty. Považovať ich za zameniteľné je chyba, ktorej má tento sprievodca predchádzať. Z ničoho z uvedeného nevyplýva protokol na domáce použitie; svetlo s vlnovou dĺžkou zodpovedajúcou absorpcii farbiva v kombinácii so systémovo podaným farbivom mení inak modulačnú expozíciu na fotochémiu sprostredkovanú fotosenzibilizátorom, ktorá patrí do rúk klinických odborníkov.