Loefflerova alkalická a polychromatická metylénová modrá: vysvetlenie farbenia

Na pracovnom stole na farbenie môžu vedľa seba stáť tri fľaše, každá označená ako určitý variant metylénovej modrej. Na jednej je napísané vodná metylénová modrá 1%. Na druhej Loefflerova alkalická metylénová modrá. Na tretej polychromatická metylénová modrá. Zaneprázdnený pracovník siahne po tej, ktorá je najbližšie. Náter sa potom zafarbí príliš slabo, príliš rovnomerne namodro alebo v neočakávaných odtieňoch fialovej a príčina sa pripíše vzorke.

Ide o problém zloženia roztoku, nie o problém vzorky. Tieto tri roztoky obsahujú príbuzné farbivá, ale predstavujú odlišné koncepcie farbenia. Jeden je jednoduché katiónové farbivo pri takmer neutrálnom pH. Druhý obsahuje to isté farbivo, ktorého pôsobenie zosilňuje zásada. Tretí už vôbec nie je jediným farbivom, ale zámerne oxidovanou zmesou. Ak použijete nesprávny roztok, princíp farbenia sa vám zmení priamo pod rukami.

Stručná odpoveď

Bežná vodná metylénová modrá je východiskovým variantom: približne 1% farbiva vo vode, jednoduché katiónové farbivo na pozorovanie morfológie baktérií a všeobecnú mikroskopiu. Pri Loefflerovej alkalickej metylénovej modrej sa do alkoholového zásobného roztoku zriedeného vodou pridáva malé, odmerané množstvo zriedenej zásady. Tým sa zvýši pH a podporí sa väzba katiónového farbiva na kyslé bakteriálne štruktúry. Polychromatická metylénová modrá je metylénová modrá, ktorá zámerne vyzrievala oxidáciou v alkalickom prostredí. Fľaša preto obsahuje zmes demetylovaných homológov (azure A, azure B, azure C), tionínu a metylénovej violeti spolu so zvyškovou metylénovou modrou. Táto zmes farbí rôzne štruktúry rôznymi odtieňmi.

Ak si máte zapamätať iba jednu vetu: alkalizácia mení intenzitu farbenia, zatiaľ čo polychromatizácia mení farby.

Bežná vodná metylénová modrá: referenčný bod

Najjednoduchším zložením je metylénová modrá rozpustená vo vode, bežne v koncentrácii 1% w/v, bez zásady a bez oxidácie. Farebnou zložkou je metyltioníniový katión s chloridovým protiónom, malé ploché fenotiazínové farbivo opísané v zázname o metylénovej modrej v databáze PubChem ako metyltioníniumchlorid. Ako katión sa viaže na fosfátovú kostru nukleových kyselín a kyslé skupiny na bakteriálnych bunkových stenách, čím farbí bunky namodro na svetlom pozadí.

Jej výhodou je predvídateľnosť. Jadrá a baktérie sa zobrazujú namodro. Kontrast je mierny. Slabo viditeľné mikroorganizmy sa môžu zafarbiť nevýrazne, čo je presne obmedzenie, ktoré sa Loeffler pokúsil odstrániť. Širšiu skupinu jednoduchých bakteriálnych farbení, do ktorej tento roztok patrí, približuje prehľad jednoduchého farbenia baktérií. Aj tu je dôležité dôsledne overovať identitu farbiva: metylová modrá je úplne iná molekula, ako vysvetľuje článok metylová modrá verzus metylénová modrá. Vyhľadávanie v katalógu iba podľa názvu farby preto môže viesť k výberu nesprávnej triedy farbiva.

Loefflerova alkalická metylénová modrá: rovnaké farbivo, intenzívnejšie pôsobenie

Klasický Loefflerov recept kombinuje alkoholový zásobný roztok metylénovej modrej so zriedenou zásadou vo vode. Učebnicové verzie uvádzajú 0.3 g farbiva v 30 mL 95% etanolu plus 100 mL 0.01% vodného roztoku hydroxidu draselného (alebo ekvivalentne 30 mL nasýteného alkoholového roztoku metylénovej modrej, 100 mL destilovanej vody a 1 mL 1% KOH). Výsledkom je pracovný roztok s koncentráciou farbiva približne 0.3% pri výrazne alkalickom pH. Komerčné verzie sa riadia rovnakým princípom a katalóg mikrobiologických farbív Thermo Fisher uvádza Loefflerovu alkalickú metylénovú modrú popri polychromatických a vodných variantoch ako samostatné katalógové položky s odlišným určeným použitím.

Podstatou je zásada. Zvýšenie pH deprotonuje karboxylové a fosfátové skupiny vo vzorke, čím zvyšuje hustotu záporne nabitých väzbových miest. Alkoholový zásobný roztok pritom udržiava farbivo úplne rozpustené, takže sa k týmto miestam dostáva v monomérnej forme. Výsledkom je rýchlejšie a intenzívnejšie farbenie baktérií než pri neutrálnom vodnom farbive, so známymi sýtomodrými tyčinkami a kokmi bežného bakteriologického náteru. Čas farbenia je zvyčajne jedna až tri minúty, po ktorých nasleduje opláchnutie vodou.

Klasickým použitím je Corynebacterium diphtheriae kultivované na Loefflerovom sérovom médiu: štíhle, často kyjakovité tyčinky s výrazne zafarbenými metachromatickými Babesovými-Ernstovými granulami zásobného polyfosfátu. Spojenie média a farbiva má historický pôvod, obe sa pripisujú tomu istému bakteriológovi a kontrast granúl je ich diagnostickým prínosom. Okrem práce s diftériou slúži tento roztok ako všeobecné bakteriologické farbivo na nátery z kultúr, na pozorovanie morfológie Neisseria v klinických náteroch a všade tam, kde Gramovo farbenie nie je potrebné, no bežná vodná modrá poskytuje príliš slabé zafarbenie. Ide o monochromatické farbenie. Všetko kyslé získa určitý odtieň modrej. Ak protokol vyžaduje farebné rozlíšenie, samotná zásada ho nedokáže zabezpečiť.

Jedno praktické upozornenie: alkalické roztoky farbív sa počas skladovania a pri absorpcii oxidu uhličitého znehodnocujú a tvoria zrazeniny. Laboratóriá preto buď pripravujú menšie objemy, alebo kupujú katalógový roztok a dodržiavajú jeho dobu použiteľnosti namiesto toho, aby sa snažili udržať pri živote starú fľašu, z ktorej sa už na každé sklíčko dostáva usadenina.

Polychromatická metylénová modrá: jeden názov, viacero farbív

Polychromatická metylénová modrá vychádza z rovnakého farbiva, ktoré sa však podrobuje riadenej oxidácii v alkalickom prostredí, historicky nazývanej vyzrievanie alebo polychromatizácia. Alkalické starnutie, zahrievanie s uhličitanom alebo oxidácia činidlami, ako je dichróman, postupne odstraňujú metylové skupiny z dimetylamínových substituentov. Produktom je zmes: zvyšková metylénová modrá spolu s azure B (strata jedného metylu), azure A a azure C (ďalšia demetylácia), tionínom (úplná demetylácia) a vedľajšími oxidačnými produktmi zo skupiny metylénovej violeti. Každá zložka má vlastný odtieň a afinitu k tkanivám, takže zmes farbí metachromaticky: jadrá, granuly, mucíny a chrupavka získavajú odlišné tóny od modrej po červenofialovú.

Táto chémia je rovnaká ako chémia, na ktorej sú založené známe farbenia krvi. Prví výskumníci zistili, že alkalizovaná metylénová modrá farbí jadrá parazitov malárie v odtieňoch fialovej, no ich vodné vyzreté roztoky boli nestabilné a v priebehu niekoľkých dní tvorili zrazeniny. Prehľad o tom, ako vzniklo fialové farbenie krvi, opisuje, ako Malachowski a Romanowsky v roku 1891 nezávisle využili tento účinok, ako sa zaviedol metanol na stabilizáciu zrazeniny farbiva a fixáciu náterov bez tepla a ako Giemsa neskôr štandardizoval zmes s odmeraným množstvom azure B a eozínu, stabilizovanú glycerolom. Moderné farbenia Giemsovho typu priamo vychádzajú z polychromatickej metylénovej modrej a eozínu, kombinácie, ktorá vytvára Romanowského efekt. Podrobnosti o kombinácii s eozínom a zložke azure B nájdete v článku farbenia Romanowského typu a interakcia azure B s eozínom.

Keďže ide o zmes, polychromatická metylénová modrá je zo svojej podstaty najmenej štandardizovaná z týchto troch variantov. Jej presné zastúpenie odtieňov závisí od spôsobu a rozsahu oxidácie. Preto ju dodávatelia pre histológiu predávajú ako samostatný produkt s vlastným testovaním funkčných vlastností, nie ako zostarnutý Loefflerov roztok. Medzi typické použitia patrí metachromatické znázornenie granúl mastocytov, mucínov a chrupavky, detailov plazmatických buniek a Helicobacter pylori v tkanivových rezoch pomocou polychromatických metód Goodpastureovho typu. Je správnou voľbou, keď je cieľom farebné rozlíšenie, a nesprávnou voľbou, keď protokol očakáva čistý monochromatický obrys baktérie.

Porovnanie zloženia a účelu

Tabuľku čítajte ako pomôcku pri rozhodovaní. Ak sa vzorka farbí príliš slabo, zmeňte prístup k pH a siahnite po Loefflerovom roztoku. Ak sa zafarbí všetko, ale nič sa navzájom neodlišuje, zmeňte koncepciu farbiva a siahnite po polychromatickom variante. Ak náter farbený Loefflerovým roztokom krásne zobrazuje granuly, no nadriadený sa pýta, prečo majú jadrá a cytoplazma rovnakú modrú farbu, odpoveďou je, že žiadne alkalické monochromatické farbivo nedokáže zabezpečiť takéto rozlíšenie. Táto úloha patrí do skupiny polychromatických farbív a jej derivátov na farbenie krvi.

Ako sa vyhnúť bežným zámenám

Za väčšinou nejasností stoja dve chyby. Prvou je považovať Loefflerov roztok za zameniteľný s bežnou metylénovou modrou, pretože oba vo fľaši vyzerajú modro. Líšia sa pH a intenzitou. Ak tam, kde je predpísaný Loefflerov roztok, použijete neutrálne farbivo, stratíte presne ten kontrast granúl, na ktorom je protokol založený. Druhou chybou je považovať akúkoľvek starú alebo náhodne zostarnutú alkalickú modrú za polychromatickú. Nekontrolované starnutie vytvára neznámu zmes s neznámou farbiacou silou, zatiaľ čo skutočné polychromatické roztoky sa pripravujú definovanými oxidačnými postupmi a v skupine farbív na krv sa kombinujú s odmeraným množstvom eozínu. História je tu poučná: nestabilné vodné vyzreté roztoky z 90. rokov 19. storočia nahradili stabilizované metanolové formulácie práve preto, že nekontrolované zmesi sa nedali reprodukovať. Toto poučenie stojí za pripomenutie pred farbením diagnostického preparátu roztokom z fľaše neistého veku.

Dôslednosť v názvoch uzatvára celý postup. Overte katalógovú položku (vodná verzus Loefflerova verzus polychromatická), obsah farbiva a určené použitie na etikete namiesto toho, aby ste ich odhadovali podľa farby. Tieto tri formulácie majú spoločného chromofórového predka. Nemajú spoločný účel.