Jednoduché farbenie metylénovou modrou verzus Gramovo farbenie: čo môže každá metóda preukázať

Študent pripraví náter z kultúry označenej ako E. coli, na jednu minútu ho zaleje metylénovou modrou, opláchne a pozrie sa cez olejový imerzný objektív. Zorné pole vypĺňajú modré tyčinky. V laboratórnom protokole stojí: „Gramnegatívne tyčinky identifikované ako E. coli.“ Pozorovanie je správne. Tento preparát však takýto záver neopodstatňuje.

Chyba je v chápaní metódy, nie v technike. Študent pristupoval k jednoduchému farbeniu, akoby išlo o diferenciačný test. Jednoduché farbenie a Gramovo farbenie odpovedajú na odlišné otázky, pretože vychádzajú z odlišných princípov farbenia. Jedno sa pýta: aký tvar je prítomný. Druhé sa pýta: ako sa bunková stena správa pri skúške. Ak si tieto dve metódy pomýlite, aj správne zafarbený preparát povedie k neopodstatnenému zápisu.

Toto porovnanie rozlišuje obe metódy, ukazuje, aké tvrdenia jednotlivé výsledky oprávňujú vysloviť, a odpovedá na dve najčastejšie otázky študentov: možno metylénovú modrú použiť pri Gramovom farbení a čo vlastne ukazuje farbenie E. coli metylénovou modrou.

Stručná odpoveď

Jednoduché farbenie metylénovou modrou zafarbí každú farbiteľnú bunku rovnakou modrou farbou, takže odhaľuje morfológiu (tyčinky, guľovité bunky, špirály) a usporiadanie (jednotlivo, v pároch, v retiazkach), no nič nehovorí o zaradení podľa Grama. Gramovo farbenie pridáva jód, krok odfarbovania a kontrastné farbivo, takže rozdeľuje baktérie na grampozitívne (fialové) a gramnegatívne (ružové alebo červené) podľa toho, ako ich bunkové obaly zadržiavajú farbivo. Modré tyčinky po farbení metylénovou modrou znamenajú „sú prítomné bunky tyčinkovitého tvaru“. Ružové tyčinky po úplnom postupe Gramovho farbenia znamenajú „sú prítomné gramnegatívne tyčinky“. Druhé tvrdenie má väčšiu výpovednú hodnotu, pretože postup zahŕňal dodatočnú skúšku.

Širšiu skupinu metód farbenia baktérií jedným farbivom, do ktorej patrí aj tento článok, nájdete v atlase farbenia pre mikroskopiu.

Jednoduché farbenie: jedno farbivo, jedna otázka

Metylénová modrá je zásadité (katiónové) farbivo. Jej farebný ión nesie kladný náboj a viaže sa na záporne nabité štruktúry v bunke vrátane nukleových kyselín a kyslých povrchových skupín, takže bunky vyzerajú na svetlom pozadí modré. OpenStax opisuje tento princíp pozitívneho farbenia v kapitole o farbení. Samotný katión farbiva je malý plochý fenotiazínový ión podrobne opísaný v chemickom prehľade metylénovej modrej; chloridový protiión sa na sfarbení nepodieľa.

Štandardný výučbový protokol je zámerne jednoduchý: pripravte tenký náter, nechajte ho vyschnúť na vzduchu, fixujte teplom, zalejte približne 1% vodným roztokom metylénovej modrej asi na jednu minútu, jemne opláchnite vodou, osušte prikladaním savého papiera a pozorujte s olejovou imerziou. Výučbový protokol LibreTexts uvádza presne tento postup s 1% roztokom a časom jednej minúty, pričom poznamenáva, že niektoré laboratóriá čas predlžujú. Žiadne moridlo, žiadne odfarbovacie činidlo, žiadne druhé farbivo. Práve táto absencia je podstatná. Pri použití jediného farbiva bez jeho selektívneho odstránenia bude mať každá bunka, ktorá farbivo naviaže, nakoniec rovnakú farbu.

Pri E. coli sa v zornom poli očakávajú modré tyčinky (bacily), jednotlivo, v pároch alebo v malých zoskupeniach. Modrá farba pochádza z farbiva. Tyčinkovitý tvar je vlastnosťou organizmu. Táto kombinácia však organizmus neidentifikuje, pretože mnohé druhy majú tyčinkovitý tvar a mnohé tyčinky sa pri jednoduchom farbení zafarbia na modro. ATCC vo svojej príručke kultivácie mikroorganizmov výslovne uvádza toto obmedzenie iba na morfológiu. Správny zápis znie: „pozorované modré bacily“. Akékoľvek tvrdenie nad rámec tvaru a usporiadania si vyžaduje ďalšie dôkazy.

Gramovo farbenie: štyri činidlá, jedna skúška správania

Gramovo farbenie je diferenciačné farbenie. Všetky bunky podrobuje rovnakej postupnosti krokov a sleduje, ktoré bunky si ponechajú prvé farbivo a ktoré ho stratia. Protokoly Gramovho farbenia Americkej spoločnosti pre mikrobiológiu definujú štandardné poradie štyroch krokov: kryštálová violeť (primárne farbivo), Gramov jódový roztok (moridlo), alkohol alebo zmes acetónu a alkoholu (odfarbovacie činidlo), potom safranín (kontrastné farbivo).

Štandardný výučbový model vysvetľuje toto rozdelenie štruktúrou bunkového obalu. Grampozitívne bunky majú hrubú peptidoglykánovú stenu, ktorá sa pri premývaní alkoholom dehydratuje a zadržiava komplex kryštálovej violeti s jódom. Gramnegatívne bunky majú tenkú peptidoglykánovú vrstvu a vonkajšiu membránu bohatú na lipidy, ktorú odfarbovacie činidlo naruší, takže komplex sa vymyje a bunky následne prijmú safranín. Prehľad Gramovho farbenia v NCBI Bookshelf uvádza toto vysvetlenie založené na bunkovej stene. Odborníci dodávajú, že celkový fyzikálno-chemický mechanizmus je zložitejší než samotná hrúbka steny, no pri interpretácii v laboratóriu toto pravidlo správania platí: fialová znamená zadržanie farbiva, ružová jeho stratu a následné kontrastné dofarbenie.

Ilustračné panely. Štylizované kresby na porovnanie metód, nie mikrofotografie zhotovené kamerou. Farby sú zjednodušené na vysvetlenie princípu: jedna farba pri jednoduchom farbení, dve farby po odfarbovaní v rámci Gramovho farbenia.

Možno metylénovú modrú použiť pri Gramovom farbení

Táto otázka má dva významy a každý si vyžaduje inú odpoveď.

Prvý význam: môže jediné zaliatie metylénovou modrou nahradiť celý postup Gramovho farbenia? Nie. Bez jódu, odfarbovacieho činidla a kontrastného farbiva chýba diferenciačný krok, takže sa netestuje zaradenie podľa Grama. Modré zorné pole po použití samotnej metylénovej modrej je výsledkom jednoduchého farbenia, aj keď fľaša stojí vedľa činidiel na Gramovo farbenie. Nezapisujte ho ako výsledok Gramovho farbenia.

Druhý význam: môže metylénová modrá nahradiť safranín ako kontrastné farbivo v kroku 4? Z funkčného hľadiska môže zafarbiť odfarbené bunky a učebnicové cvičenie pri takejto zámene predpokladá fialové grampozitívne bunky a modré gramnegatívne bunky. Táto úvaha je správna, pretože správne odfarbené gramnegatívne bunky sú takmer bezfarebné a prijmú ďalšie katiónové farbivo. Nie je to však štandardný protokol. Protokoly ASM predpisujú safranín, pričom v niektorých variantoch uznávajú alternatívy, ako je zásaditý fuchsín, nie metylénovú modrú. Má to aj praktickú nevýhodu: modrá sa od fialovej odlišuje ťažšie než ružová od fialovej, najmä pre začiatočníkov a najmä pri slabnúcich lampách mikroskopu. Pri výučbe a pri každom výsledku, na ktorom záleží, používajte kontrastné farbivo uvedené vo vašom protokole, zvyčajne safranín, a metylénovú modrú ako kontrastné farbivo považujte za demonštračný variant, nie za rovnocenný štandard.

Súvisiaca otázka, ako sa metylénová modrá líši od iných možností farbenia jedným farbivom, je rozobratá v porovnaní jednoduchých farbení baktérií.

Čo farbenie E. coli metylénovou modrou preukazuje a čo nie

E. coli je gramnegatívna tyčinka, ale táto veta spája poznatky z viacerých metód: morfológiu z mikroskopie, Gramovu reakciu z Gramovho farbenia a identitu z kultivácie spolu s biochemickými alebo molekulárnymi testami. Náter zafarbený metylénovou modrou prispieva iba prvou časťou. Preukazuje, že v zafarbenej vzorke sú prítomné bunky tyčinkovitého tvaru a ako sú usporiadané. Nepreukazuje Gramovu reakciu, pretože neprebehla skúška odfarbovania. Neidentifikuje druh, pretože tyčinky mnohých druhov vyzerajú pri tomto rozlíšení podobne.

Práve tu vzniká v zápisoch predvídateľná chyba. Autor prenesie predchádzajúce poznatky („táto kultúra má byť E. coli a E. coli je gramnegatívna“) do záznamu pozorovania, takže preparát zdanlivo potvrdzuje niečo, čo sa v skutočnosti iba predpokladalo. Presnejší zápis oddeľuje jednotlivé úrovne: „Jednoduché farbenie metylénovou modrou: pozorované modré bacily; iba morfológia, zaradenie podľa Grama sa netestovalo.“ Potom, ak bolo Gramovo farbenie vykonané správne s kontrolami: „Gramovo farbenie: ružové tyčinky, čo zodpovedá gramnegatívnym baktériám.“ Určenie druhu prichádza neskôr, na základe identifikačného postupu, nie iba farby.

Praktický sprievodca interpretáciou

Pri práci v laboratóriu používajte toto rozhodovacie pravidlo. Ak majú všetky bunky jednu farbu a protokol používal jedno farbivo bez odfarbovacieho činidla, vykonali ste jednoduché farbenie. Uveďte tvar, odhad veľkosti a usporiadanie. Tým skončite. Ak protokol zahŕňal kryštálovú violeť, jód, odfarbovacie činidlo a kontrastné farbivo spolu so známymi pozitívnymi a negatívnymi kontrolami, vykonali ste Gramovo farbenie. Uveďte farbu aj morfológiu: fialové koky v retiazkach, ružové tyčinky a podobne.

Väčšinu nejasností spôsobujú tri chyby. Po prvé, prehnaná interpretácia modrých tyčiniek ako potvrdenia E. coli. Po druhé, zaznamenanie preparátu farbeného metylénovou modrou pod nadpis „Gramovo farbenie“ v laboratórnom denníku, čo neskorší čitatelia nesprávne pochopia. Po tretie, svojvoľné zamieňanie kontrastných farbív a následné porovnávanie farieb medzi laboratóriami, akoby používali rovnakú farebnú škálu. Každá z týchto chýb má rovnaké riešenie: pomenujte metódu, ktorá sa skutočne vykonala, a tvrdite iba to, čo táto metóda testuje.

Jednoduché farbenie má svoje miesto práve preto, že umožňuje vysloviť len obmedzené závery. Je rýchle, toleruje drobné odchýlky v postupe a postačuje, keď sa otázka týka morfológie: je tam niečo a aký to má tvar? Keď ide o klasifikáciu, vykonajte diferenciačný test. Modrý preparát vám povie, ako bunky vyzerajú. Fialový alebo ružový preparát vám povie, ako sa správajú ich steny. Ani jeden preparát vám sám osebe neurčí druh.