Článok
Farbenie buniek sliznice líca metylénovou modrou: čo pozorovať
Žiačka položí kvapku suspenzie buniek sliznice líca na podložné sklíčko, pozrie sa do mikroskopu a takmer nič nevidí. Jasným zorným poľom sa pohybuje niekoľko bledých prízrakov. Skúsi doostriť, potom pridá svetlo a napokon usúdi, že sklíčko je prázdne. Sklíčko však prázdne nie je. Bunky tam sú. Sú takmer priehľadné a práve priehľadnosť je problém, ktorý má toto farbenie vyriešiť.
Tento nesúlad medzi očakávaním a obrazom stojí za to pomenovať ešte pred začiatkom postupu. Začiatočníci očakávajú, že mikroskop odhalí detaily podobne, ako priblíženie fotoaparátu ukáže vzdialenú tabuľu. Mikroskop so svetlým poľom robí niečo konkrétnejšie: zobrazuje rozdiely v absorpcii svetla. Nefarbená bunka sliznice líca neabsorbuje takmer žiadne svetlo, a preto vytvára takmer nulový rozdiel. Metylénová modrá tento rozdiel dodáva. Vo vnútri bunky sa viaže nerovnomerne a premieňa štruktúru na kontrast. Keď žiaci pochopia tento princíp, každý ďalší krok im bude dávať zmysel ako jeho dôsledok, nie ako pokyn z receptu.
Pomôžu tu základné informácie o tom, ako jednoduché farbenie zvyšuje kontrast v školskom laboratóriu. Zopakovanie nastavenia mikroskopu so svetlým poľom pred farbením predíde polovici nevydarených preparátov. Chémiu, ktorá stojí za farbou, vysvetľuje úvod do používania metylénovej modrej v mikroskopii, ktorý objasňuje, prečo sa práve toto farbivo stále objavuje na laboratórnom stole.
Školský postup
Nižšie uvedený postup prípravy vlhkého preparátu je jednoduchšou základnou voľbou pre bežné vyučovanie. Nevyžaduje plameň ani fixáciu. Variant s fixovaným náterom, používaný v niektorých vysokoškolských príručkách, pridáva sušenie na vzduchu a krátku tepelnú fixáciu, ako napríklad v cvičení s náterom buniek sliznice líca z North Central Texas College uverejnenom na Biology LibreTexts. Tepelná fixácia je však zaužívaným mikrobiologickým postupom, nie podmienkou pozorovania epitelových buniek.
Čo potrebujete: čisté podložné a krycie sklíčka, sterilné jednorazové odberové tyčinky (uprednostňovaná možnosť) alebo nové ploché špáradlá, fľaštičku s kvapkadlom s 0.5 až 1 percentným vodným roztokom metylénovej modrej, destilovanú alebo deionizovanú vodu, savý papier, rukavice a zložený mikroskop s celkovým zväčšením 100x a 400x.
- Vypláchnite si ústa čistou vodou. Odstránite tak zvyšky jedla, ktoré sa neskôr intenzívne zafarbia a odpútajú pozornosť od buniek.
- Každý žiak odoberá vzorku iba z vlastného líca. Jemne pretrite vnútornú stranu líca novou sterilnou odberovou tyčinkou. Pritláčajte, neškrabte. Prestaňte skôr, než by sa objavil akýkoľvek nepríjemný pocit alebo krvácanie.
- Odberovou tyčinkou valivým pohybom vytvorte tenkú vrstvu v strede čistého podložného sklíčka. Tenká vrstva je najdôležitejším predpokladom dobre pozorovateľného preparátu. Hrubá biela vrstva sa zafarbí na nerozlíšiteľnú modrú masu.
- Na náter pridajte jednu kvapku metylénovej modrej. Nechajte pôsobiť 1 až 3 minúty. V mnohých vysokoškolských postupoch stačí jedna minúta; laboratórna príručka prírodných vied NCERT pre IX. ročník pri dočasnom preparáte používa približne 3 minúty. Dlhšie neznamená lepšie a prefarbenie je najčastejšou chybou pri načasovaní.
- Podľa miestneho postupu jemne opláchnite destilovanou vodou alebo odsajte prebytočné farbivo savým papierom. Pozadie by malo byť bledomodré, nie tmavomodré.
- Krycie sklíčko prikladajte pod uhlom tak, aby sa najprv dotklo jedným okrajom, a potom ho pomaly spustite. Zabránite tak vzniku vzduchových bublín.
- Začnite pri malom zväčšení, aby ste našli bunky, overili zaostrenie a vycentrovanie, potom prejdite na 100x a napokon na 400x. Pri zväčšení 400x používajte iba jemné zaostrovanie.
Koncentrácia farbiva si zaslúži jednu spresňujúcu vetu. Školské postupy sa zvyčajne pohybujú okolo 1 percentného vodného roztoku metylénovej modrej. Koncentrovanejší zásobný roztok alebo dlhé pôsobenie stmavujú pozadie rýchlejšie než jadro, čím obracajú kontrast, od ktorého toto cvičenie závisí.
Bezpečná manipulácia s materiálom zo sliznice líca
Vzorky zo sliznice líca obsahujú sliny a bežné ústne mikroorganizmy, preto s každým čerstvým náterom zaobchádzajte ako s potenciálne infekčným materiálom, aj keď darcami sú zdraví spolužiaci. Usmernenia Americkej mikrobiologickej spoločnosti pre biologickú bezpečnosť vo výučbových laboratóriách uvádzajú všeobecné zásady: pred hodinou posúďte riziko, noste rukavice, pri možnosti postriekania si chráňte oči, po práci si umyte ruky, dezinfikujte pracovné stoly a kontaminované jednorazové pomôcky likvidujte schváleným spôsobom ako biologický odpad.
Väčšinu rizík pokrývajú štyri školské pravidlá. Jedna odberová tyčinka a jedno sklíčko patria jednému darcovi, nikdy sa nezdieľajú. Odoberajte vzorku iba sebe, nikdy spolužiakovi. Jednorazové odberové tyčinky a špáradlá patria priamo do určenej nádoby na odpad, nikdy späť na pracovný stôl. Samotná metylénová modrá farbí pokožku a oblečenie a dráždi oči, preto používajte rukavice a dodržiavajte bežné hygienické zásady pri práci s farbivami. Toto cvičenie nerozširujte o kultiváciu čohokoľvek z náteru a neimprovizujte tepelnú fixáciu čerstvého ľudského materiálu mimo školského bezpečnostného postupu.
Čo pozorovať a prečo to tak vyzerá
Pri zväčšení 100x hľadajte široké ploché bunky bledomodrej farby s nepravidelnými oválnymi alebo mnohouholníkovými obrysmi. Ležia jednotlivo alebo vo voľných prekrývajúcich sa vrstvách. V každej bunke sa zvyčajne nachádza jedna tmavšia modrá škvrna. Táto škvrna je jadro. Všimnite si aj usporiadanie: bunky dlaždicového epitelu sú tenké doštičky, nie gule, preto ich okraje pripomínajú skôr popraskanú glazúru než okrúhle balóniky.
Pri zväčšení 400x možno jasne rozlíšiť tri znaky. Hranica bunky sa javí ako tenká tmavšia čiara ohraničujúca bunku. Cytoplazma vypĺňa vnútro rovnomernou svetlomodrou farbou. Jadro je tmavšie a kompaktnejšie, často oválne, zvyčajne blízko stredu, ale nie vždy. Požiadajte žiakov, aby zaznamenali všetky tri znaky spolu s tvarom a zväčšením, pretože presne to od nich vyžaduje pracovný list.
Dôležitý je tu jeden bod týkajúci sa presnosti, ktorý mnohé pracovné listy uvádzajú nesprávne. Viditeľná hranica zodpovedá oblasti plazmatickej membrány, ale samotná membrána, lipidová dvojvrstva hrubá približne 7 až 10 nanometrov, je hlboko pod rozlišovacou schopnosťou školského mikroskopu. Žiaci vidia optický okraj bunky spolu s farbivom, ktoré sa tam nahromadilo. Rovnaká opatrnosť platí aj pri organelách. Mitochondrie, endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát ani ribozómy v tomto preparáte nevidno. Bežný svetelný mikroskop za dobrých podmienok rozlíši detaily až približne do 0.2 mikrometra, ako vysvetľuje prehľad mikroskopických nástrojov v bunkovej biológii od NCBI, a väčšina ultraštruktúry sa nachádza pod touto hranicou alebo blízko nej. Väčšie prázdne zväčšenie zväčší obraz bez pridania detailov.
Prečo sa jadro farbí najtmavšie? Metylénová modrá je katiónové farbivo, v roztoku má kladný náboj a viaže sa na záporne nabitý materiál v bunke, predovšetkým na nukleové kyseliny. Chromatín sústreďuje DNA v jadre, takže jadro zachytí najviac farbiva. Cytoplazma obsahuje RNA a ďalšie nabité molekuly, preto sa farbí tiež, ale rozptýlenejšie a svetlejšie. Dôležité spresnenie: metylénová modrá nie je farbivo špecifické pre DNA. Práca o distribúcii metylénovej modrej pri zobrazovaní bunkového jadra opisuje väzbu katiónu na oblasti bohaté na nukleové kyseliny a staršia kvantitatívna práca o väzbe metylénovej modrej v bunkových preparátoch zistila, že väčšina naviazaného farbiva bola spojená s nukleovými kyselinami. Tmavé jadro a svetlá cytoplazma teda predstavujú vzor kontrastu, nie molekulovú analýzu.
Chyby, ktoré žiaci urobia, a ako ich rozpoznať
Takmer každý nevydarený preparát zodpovedá jednému z piatich vzorov. Naučte žiakov posúdiť problém s preparátom namiesto toho, aby ho slepo pripravovali znova.
Prefarbenie spôsobí, že bunky aj pozadie sú rovnomerne tmavé a jadro sa stratí v zornom poli. Napravte to kratším časom farbenia alebo dôkladnejším opláchnutím. Nedostatočné farbenie zanechá bledé obrysy, ktoré pri zvýšení intenzity svetla zmiznú; predlžujte čas po tridsiatich sekundách. Hrubé nátery vytvárajú husté prekrývajúce sa masy, v ktorých nemožno sledovať žiadny obrys; náprava je mechanická — nabudúce vytvorte tenšiu vrstvu, pretože žiadne opláchnutie nezachráni kopu buniek. Vzduchové bubliny sa javia ako dokonalé kruhy s ostrými tmavými okrajmi a mätú začiatočníkov, ktorí si ich zamieňajú za štruktúry; krycie sklíčko znovu pomaly priložte pod uhlom. Drobné tmavé bodky rozptýlené na bunkách alebo okolo nich sú zvyčajne bežné ústne baktérie, ako uvádzajú školské postupy, napríklad postup pozorovania buniek sliznice líca od Ingrid Science. Potvrdzujú, že ústa sú osídlené, čo si žiaci možno dobre zapamätajú, ale v tomto cvičení nemožno určiť ich druh a nemali by sa kresliť ako časti bunky. Zvyšky jedla a vlákna hlienu sa farbia nepravidelne a intenzívne; úvodné vypláchnutie slúži na ich obmedzenie.
Čo toto cvičenie nedokáže
Ide o vzdelávacie pozorovanie, nie o diagnostický test. Na základe vzhľadu buniek pri školskom farbení nemožno diagnostikovať infekciu, rakovinu ani žiadne ochorenie a článok by sa nemal chápať ako náznak opaku. Preparát ukazuje tvar, hranicu, cytoplazmu a jadro pri dvoch zväčšeniach. Nezobrazuje ultraštruktúru membrány, detaily organel ani molekulovú identitu. Výslovné pomenovanie tohto obmedzenia chráni vedeckú presnosť aj žiakov: dobrým výsledkom je správne označená kresba so zaznamenaným zväčšením a farbivom, nie záver o zdraví.
Pracovný list pre žiakov a mikrofotografie s popismi
Dva projektové materiály k tejto stránke sú mikrofotografia s popismi uvedená vyššie a pracovný list uvedený nižšie. Vytlačte pracovný list pre každého žiaka alebo ho premietnite a nechajte žiakov prekresliť políčka do zošitov.
Ako ho použiť počas 45 minútovej hodiny: desať minút na bezpečnostné poučenie a odber vzoriek, desať minút na farbenie a prípravu preparátu, pätnásť minút na pozorovanie a kreslenie pri oboch zväčšeniach, desať minút na kontrolný zoznam a porovnanie s mikrofotografiou s popismi. Položky kontrolného zoznamu sú zámerne jednoduché a konkrétne. Tenký náter, správny čas farbenia, jadro tmavšie než cytoplazma, zaznamenané zväčšenie. Žiak, ktorý dokáže zaškrtnúť všetky štyri, pochopil princíp, ktorý má táto hodina naučiť: mikroskopy zobrazujú rozdiely a farbivá vytvárajú rozdiely, ktoré stojí za to zobraziť.