Метиленовый синий и ферроптоз: железо, перекисное окисление липидов и гибель клеток

Ферроптоз — это гибель клеток из-за повреждения мембран. Полиненасыщенные жиры в мембранах окисляются в цепной реакции, мембрана перестаёт функционировать, и клетка погибает. Для этой химии необходимо железо. Это предложение содержит всю концепцию, а всё в этой статье — проверка отдельного её компонента.

Здесь рассматривается более узкий вопрос: что делает метиленовый синий с этой цепью в клеточных экспериментах и что на самом деле показывают эти результаты. Краткий ответ: в двух лабораторных исследованиях наномолярный метиленовый синий снижал перекисное окисление митохондриальных липидов и сохранял жизнеспособность клеток после воздействий, которые в противном случае вызывают ферроптоз. Более важен подробный ответ, потому что каждое звено цепи проверялось отдельным вмешательством, и каждое вмешательство имеет свои ограничения.

Ферроптоз в одном абзаце

Фосфолипид мембраны, несущий хвост из полиненасыщенной жирной кислоты, имеет слабое место: атомы водорода, которые легко отрываются. После того как радикал забирает один из них, кислород присоединяется к липиду, образуется липидный пероксильный радикал, и этот радикал забирает атом у следующего липида. Реакция распространяется вдоль мембраны, если что-то её не остановит.

Главным сигналом остановки является фермент GPX4, который использует глутатион для восстановления липидных пероксидов до безвредных липидных спиртов. Лабораторные индукторы атакуют эту защиту в определённых точках. Erastin блокирует импорт цистина через систему xc-minus, лишая клетку цистеина для синтеза глутатиона. Бутатионин сульфоксимин напрямую блокирует синтез глутатиона. RSL3 ингибирует сам GPX4. Все три воздействия оставляют пероксиды неустранёнными, но делают это на разных этапах, поэтому результат с одним индуктором не может автоматически распространяться на другие.

Ферроптоз отличается от апоптоза свойствами, которые его определяют. При нём отсутствует каскад каспаз и апоптотические тельца. Хелаторы железа, такие как дефероксамин, и агенты, улавливающие радикалы, такие как ferrostatin-1, подавляют его, что является операционным тестом, используемым исследователями для определения ферроптотической, а не просто некротической гибели. Более широкая картина регулируемых путей клеточной гибели помогает понять это различие, а то, как клетки управляют лабильным железом, объясняет, почему хелатирование является таким важным контрольным экспериментом.

Где находятся митохондрии и почему это было предметом споров

Ранние исследования показали, что клетки без митохондриальной ДНК всё ещё проходят ферроптоз, что предполагало необязательность участия митохондрий. Более поздние работы обнаружили, что удаление митохондрий или блокирование дыхания может подавлять ферроптоз при дефиците цистеина, но не при прямом ингибировании GPX4. Оба результата могут быть верны, если вклад митохондрий зависит от индуктора, типа клетки и места возникновения решающего перекисного окисления.

Исследование, лежащее в основе этой статьи, подошло к спору с помощью компартмент-специфического зонда. MitoCLox — это версия репортера перекисного окисления липидов, направленная в митохондрии: он изменяет флуоресценцию при взаимодействии с липидными пероксильными радикалами внутри митохондрий. В фибробластах, обработанных erastin, окисление митохондриального зонда появлялось в ещё живых клетках до гибели, причём оно было неоднородным среди популяции. Этот момент имеет значение. Перекисное окисление, предшествующее гибели, является кандидатом на роль причины. Перекисное окисление, измеренное только в погибших клетках, является клеточным мусором. Дополнительное руководство по анализам перекисного окисления липидов и тому, что показывает каждый зонд объясняет, почему расположение зонда определяет значение сигнала.

Та же картина наблюдалась во второй модели. Фибробласты пациента с наследственной оптической нейропатией Лебера, несущие мутацию комплекса I и повышенный базовый окислительный стресс, погибали через ферроптоз при истощении глутатиона, тогда как контрольные фибробласты сопротивлялись. Окисление митохондриального зонда снова происходило первым. Подробности приведены в исследовании фибробластов о перекисном окислении митохондриальных липидов при ферроптозе.

Что метиленовый синий изменил в этих экспериментах

Метиленовый синий является переносчиком электронов. Его окисленная форма принимает электроны из химии, связанной с NADH и комплексом I, а восстановленная форма передаёт их цитохрому c, который подаёт их в комплекс IV. Это создаёт частичный обход участка цепи, где электроны обычно утекали к кислороду в форме супероксида. Читателям, которым нужна полная картина переноса, следует начать с того, как метиленовый синий перемещает электроны через митохондрии.

В обработанных erastin лёгочных фибробластах метиленовый синий в концентрации 250 наномолей сохранял жизнеспособность в тесте выживания клеток вместе с направленными на митохондрии антиоксидантами SkQ1 и MitoTEMPO. Контрольные эксперименты определяют границы утверждения. Ferrostatin-1, альфа-токоферол и дефероксамин также обеспечивали защиту, что подтверждает ферроптотическую природу гибели. Аналог SkQ1 без антиоксидантной группы не обеспечивал защиты, что указывает на роль окислительно-восстановительной химии, а не неспецифического накопления. Защита исчезала выше примерно 200 наномолей SkQ1, что соответствует известному прооксидантному поведению хиноновых антиоксидантов при более высокой нагрузке. Метиленовый синий также обладает двойственным поведением: он обеспечивает защитный эффект при низких наномолярных концентрациях в этих культурах и способен генерировать перекись водорода за счёт редокс-цикла при более высоких концентрациях или сильном освещении. Контекст концентраций такого типа рассматривается в активных формах кислорода в митохондриях.

Эксперименты с изолированными митохондриями затем разделили источники АФК. При наличии двухвалентного железа субстраты, питающие комплекс I, вместе с ротеноном стимулировали окисление зонда. Ротенон блокирует участок ниже флавинового центра, поэтому расположенные выше переносчики остаются восстановленными и передают электроны кислороду от флавина, обращённого к матриксу. Субстраты, питающие комплекс III, вместе с антимицином A создавали большое количество перекиси водорода, но не вызывали перекисного окисления липидов. Один и тот же общий сигнал АФК, разное расположение, разный результат. SkQ1 и метиленовый синий подавляли перекисное окисление, вызванное комплексом I, не подавляя при этом образование перекиси водорода, что помещает их действие после образования АФК — на этапе перекисного окисления липидов.

Ветка с избытком железа и подсказка от липофусцина

Второе исследование рассматривало вопрос со стороны железа. Кардиомиоциты H9c2, подвергнутые воздействию субмиллимолярного цитрата аммония железа(III), демонстрировали образование АФК в митохондриях, перекисное окисление митохондриальных липидов, затем ферроптоз, после чего в течение 24 часов накапливали пигмент, подобный липофусцину. Липофусцин — это автофлуоресцентный остаток окисленных липидов и белков, содержащий железо, который накапливается с возрастом, и его быстрое появление здесь связывает острое железозависимое перекисное окисление с классическим маркером старения. Наномолярный метиленовый синий и SkQ1 каждый по отдельности предотвращали перекисное окисление, гибель и накопление пигмента. Изолированные сердечные митохондрии подтвердили эту картину: ротенон вместе с двухвалентным железом вызывал перекисное окисление и пигментоподобный сигнал, а оба агента его блокировали. Полная последовательность описана в исследовании избытка железа в кардиомиоцитах H9c2. Аспект с пигментом относится к липофусцину и клеточным маркерам старения.

Что тесты жизнеспособности клеток не показывают

Показатель жизнеспособности, такой как CellTiterBlue, показывает, сколько клеток в чашке остаются метаболически активными после воздействия триггера и потенциального защитного агента. Это проверка механизма в определённой системе. Это не результат лечения. Ни в одном из этих экспериментов препарат не вводился пациенту, не измерялась конечная точка заболевания и не устанавливался терапевтический диапазон в организме.

Следует явно указать четыре ограничения. Во-первых, типы клеток ограничены: трансформированные лёгочные фибробласты, первичные кожные фибробласты, включая одну линию с митохондриальным заболеванием, и линия кардиомиоцитов крысы, а также изолированные митохондрии сердца крысы. Чувствительность различалась между линиями, а линия LHON была специально уязвимой по конструкции эксперимента. Во-вторых, индукторы являются лабораторными экстремальными воздействиями: полная блокада транспорта или синтеза, а также уровни железа, с которыми ткань не столкнулась бы остро. В-третьих, концентрация не переводится простым умножением. Наномолярная концентрация в культуральной среде не является человеческой дозой, а распределение метиленового синего, его восстановление до бесцветной формы в крови и тканях, воздействие света и мембранный потенциал находятся между чашкой и организмом. В-четвёртых, зонды показывают состояние именно своего компартмента. Окисление MitoCLox показывает образование митохондриальных липидных радикалов; оно не показывает напрямую, что разрыв плазматической мембраны, вероятное конечное событие, был предотвращён, а не обойдён на более раннем этапе.

Таким образом, корректное утверждение таково: в этих моделях АФК, происходящие от комплекса I, вместе с железом вызывают перекисное окисление митохондриальных липидов, предшествующее ферроптозу, а метиленовый синий в низких концентрациях прерывает этот участок цепи. Всё, что выходит за пределы этого участка, требует других экспериментов на животных, а затем на людях.